РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА ПО ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ	(19) RU (11) 2 815 711 (13) C2
	(51) МПК C12Q 1/68 (2006.01) (52) СПК C12Q 1/68 (2024.01)

Статус:	действует (последнее изменение статуса: 21.03.2024)
Пошлина:	Установленный срок для уплаты пошлины за 3 год: с 12.07.2023 по 11.07.2024. При уплате пошлины за 3 год в дополнительный 6-месячный срок с 12.07.2024 по 11.01.2025 размер пошлины увеличивается на 50%.

(21)(22) Заявка: 2022118890, 11.07.2022 (24) Дата начала отсчета срока действия патента: 11.07.2022 Дата регистрации: 20.03.2024 Приоритет(ы): (22) Дата подачи заявки: 11.07.2022 (43) Дата публикации заявки: 11.01.2024 Бюл. № 2 (45) Опубликовано: 20.03.2024 Бюл. № 8 (56) Список документов, цитированных в отчете о поиске: RU 2560280 C2, 20.08.2015. RU 2556127 C2, 10.07.2015. RU 2732448 C9, 26.05.2021. PAULA NICOLE ACOSTA AMADOR Characterization of the Cpx Response in Vibrio cholera. A thesis submitted in partial fulfillment of the requirements for the degree of Doctor of Philosophy in Microbiology and Biotechnology. Department of Biological Sciences University of Alberta, 2015. CN 0101113475 B, 06.10.2010. GHOSH P, NAHA A, PAZHANI GP, RAMAMURTHY T, MUKHOPADHYAY AK. Genetic traits of Vibrio cholerae O1 Haitian isolates that are absent in contemporary strains from Kolkata, India. PLoS One. 2014 Nov 21; 9(11). Адрес для переписки: 410005, г. Саратов, ул. Университетская, 46, ФКУН "Российский противочумный институт "Микроб"

(72) Автор(ы): Плеханов Никита Александрович (RU), Рыбальченко Дарья Александровна (RU), Щелканова Елена Юрьевна (RU), Смирнова Нина Ивановна (RU) (73) Патентообладатель(и): Федеральное казенное учреждение науки "Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФКУН "Российский противочумный институт "Микроб" Роспотребнадзора) (RU)

(54) Способ идентификации токсигенных генетических вариантов возбудителя холеры Эль Тор с набором мутаций в генах вирулентости и генах острова пандемичности VSPII методом мультиплексной полимеразной цепной реакции

Изобретение относится к области медицинской микробиологии, в частности к идентификации новых вариантов токсигенных штаммов Vibrio cholerae биовара Эль Тор, выделенных из различных источников.

Эпидемиологическая ситуация по холере во многих эндемичных регионах Азии, Африки и Америки является неблагополучной, что создает реальные риски межгосударственного и трансграничного завоза этой особо опасной инфекции на территорию Российской Федерации.

Токсигенные штаммы Vibrio cholerae серогруппы O1 биовара Эль Тор, вызвавшие три волны текущей, 7-ой, пандемии холеры, начавшейся в 1961 г. и продолжающейся до сих пор, включают в себя типичные, генетически измененные (или атипичные штаммы) и новые генетические варианты возбудителя, различающиеся по вирулентности и эпидемическому потенциалу. Основным отличием типичных и атипичных штаммов возбудителя холеры, изолированных в период первой (1962-1991 гг.) и второй волн (1991-2004 гг.) пандемии соответственно, являются разные аллели ключевых генов патогенности. Типичные штаммы имеют аллели ctxB3 и tcpA^{El Tor}, атипичные - ctxB1 - tcpA^{El Tor} или ctxB1 - tcpA^CIRS101, кодирующие В-субъединицу холерного токсина и основную субъединицу токсин-корегулируемых пилей - ключевого фактора колонизации вибрионами тонкого кишечника. Кроме того ряд штаммов несет измененный за счет делеции нескольких генов остров пандемичности VSP-II, связанный со способностью возбудителя к эпидемическому распространению штаммов. Для новых генетических вариантов, возникших в процессе эволюции в третью волну (2006 г. по настоящее время), характерны ранее неизвестные мутации в генах патогенности ctxB (аллель ctxB7) и rtxA (аллель rtxA4), кодирующих В-субъединицу холерного токсина и цитотоксин MARTX, в сочетании с протяженной делецией генов острова пандемичности VSP-IIΔ(0495-0512) и аллелем tcpA^CIRS101. Вследствие новых мутаций основными маркерами таких штаммов стали аллели генов вирулентности ctxB7, tcpA^CIRS и rtxA4, а также остров пандемичности VSP-IIΔ(0495-0512) с протяженной делецией. Эти изменения привели к значительному усилению их патогенного и эпидемического потенциала.

В настоящее время, несмотря на доминирование новых вариантов, токсигенные холерные вибрионы, циркулирующие в эндемичных очагах холеры и завезенные на территорию Российской Федерации, представлены разнообразной группой, состоящей как из ранее возникших атипичных штаммов, так и штаммов с новыми мутациями эпидемически значимых генов. Реальный риск завоза в Россию холерных вибрионов с разным набором измененных генов вирулентности и эпидемичности, способных нанести различный ущерб здоровью населения и экономике страны, указывает на необходимость разработки способа идентификации новых генетических вариантов V. cholerae O1 биовара Эль Тор для получения достоверной информации о генетических свойствах выявляемых штаммов с целью прогнозирования эпидемиологической ситуации по холере.

Известна комплексная гено- и иммунодиагностическая тест-система для идентификации холерных вибрионов O1 и O139 серогрупп и оценки их вирулентности, позволяющая осуществлять идентификацию природных штаммов холерного вибриона O1 и O139 серогрупп и определять их вирулентность [1].

Известна мультиплексная ПЦР тест-система с использованием праймеров на видоспецифичный ген hapA и основные гены вирулентности ctxA, tcpA и toxR, позволяющая одновременно проводить идентификацию штаммов V. cholerae и дифференцировать их по эпидемической значимости [2].

Описанные способы и тест-системы предназначены для детекции и идентификации штаммов холерного вибриона, определения их серогруппы и биовара, дифференциации типичных штаммов V. cholerae биовара Эль Тор по эпидемической значимости, однако они не способны выявлять новые варианты атипичных токсигенных штаммов возбудителя текущей пандемии холеры.

Известен способ и тест-система для идентификации токсигенных штаммов Vibrio cholerae O1, определения их биовара и дифференциации V. cholerae биовара Эль Тор на типичные и измененные варианты методом ПЦР [3]. Согласно этому способу мультиплексную ПЦР проводят в один прием в двух реакционных смесях, каждая из которых содержит специально подобранное сочетание праймеров: одна - к генам rfbO1, cas3 и ctxB^Class, вторая - к генам rfbO1, rtxC и ctxB^Et. Изобретение позволяет быстро и достоверно выявлять биовар холерных вибрионов O1 серогруппы, определять их токсигенность и проводить дифференциацию выявленных токсигенных штаммов V. cholerae биовара Эль Тор на типичные и атипичные.

Известен способ дифференциации штаммов V. cholerae O139 серогруппы по алкилсульфатазной активности, который позволяет подтвердить токсигенность штамма и его эпидзначимость [4].

Описан способ выявления эпидемически значимых холерных вибрионов V. cholerae Эль Тор и Vibrio cholerae O139 по их адгезивной способности для обнаружения эпидемически значимых, токсигенных и атоксигенных гемолитичных штаммов [5].

Известен способ, позволяющий идентифицировать токсигенные штаммы геновариантов V. cholerae O1 биовара Эль Тор и дифференцировать их на основе анализа структуры острова пандемичности VSP-II на штаммы с низким и высоким эпидемическим потенциалом методом мультиплексной полимеразной цепной реакции [6].

Известен способ идентификации штаммов Vibrio cholerae O1, позволяющий определять их токсигенность и биовар с дифференциацией биовара ЭльТор на типичные и генетически измененные варианты методом мультиплексной полимеразной цепной реакции с учетом результатов в режиме "реального времени" [7].

Вместе с тем, указанные способы не обеспечивают идентификацию новых вариантов атипичных штаммов, содержащих набор измененных генов, связанных с патогенным и эпидемическим потенциалом, что является необходимым для совершенствования методов молекулярно-эпидемиологического мониторинга возбудителя холеры и прогнозирования эпидемиологической ситуации.

Таким образом, в данной области существует очевидная потребность в разработке информативного и быстрого способа идентификации токсигенных новых генетических вариантов V. cholerae биовара Эль Тор.

Задачей изобретения является выбор в геноме возбудителя холеры ДНК-мишеней, определяющих принадлежность исследуемого штамма V. cholerae к новым токсигенным генетическим вариантам, подбор оптимального сочетания олигонуклеотидных праймеров и параметров полимеразной цепной реакции, позволяющей эффективно идентифицировать новые варианты возбудителя.

Техническим результатом заявляемого изобретения является повышение эффективности выявления новых токсигенных генетических вариантов возбудителя холеры Эль Тор с повышенной вирулентностью и высоким эпидемическим потенциалом.

Технический результат достигается способом идентификации токсигенных новых генетических вариантов возбудителя холеры Эль Тор методом мультиплексной полимеразной цепной реакции, которая предусматривает выделение хромосомной ДНК исследуемого штамма, проведение одностадийной мультиплексной полимеразной цепной реакции в двух реакционных смесях, первая из которых содержит специально подобранное сочетание праймеров к генам ctxA, ctxB7, tcpA^CIRS101, а вторая - rtxA, vc0502, vc0514, с последовательным понижением температуры отжига праймеров с 58 до 54°С с интервалом в 2°С каждые пять циклов амплификации при общем количестве циклов амплификации равном 35 (табл. 2), с последующим электрофоретическим анализом полученных амплифицированных фрагментов генов исследуемых и контрольных штаммов.

Последовательности праймеров ctxA-F - ctxA-R, tcpA-F2 - tcpA-Rev, rtxA4-F - rtxA4-R2, vc0502-F - vc0502-R, vc0514-F - vc0514-R, ctxB7-F3 взяты из литературных источников, праймер ctxB7-R рассчитан авторами с целью оптимизации размера ампликона для лучшего разделения продуктов амплификации в геле.

Пары праймеров, используемые в заявляемом способе:

ctxA-F - 5'-CGGGCAGATTCTAGACCTCCTG-3'

ctxA-R - 5'-CGATGATCTTGGAGCATTCCCAC-3' - праймеры на ген ctxA, кодирующий синтез субъединицы А холерного токсина, обеспечивающие амплификацию фрагмента размером 564 п.н. [8];

ctxB7-F3 - 5'-GTTTTACTATCTTCAGCATATGCGA-3'

ctxB7-R - 5'-ATCGCATGAGGCGTTTTATT-3' - праймеры на аллель ctxB7 (С⇒А р: 59 от начала гена) гена ctxB, кодирующего синтез субъединицы В холерного токсина, с помощью которых образуется ПЦР-продукт размером 300 п.н. [9];

tcpA^CIRS101-F2 - 5'-CCAGCTACCGCAAACGCAGG-3'

tcpA^CIRS101-Rev - 5'-CCGACTGTAATTGCGAATGC-3' - праймеры на аллель tcpA^CIRS (A⇒G р: 266 от начала гена) гена tcpA, кодирующего основную субъединицу токсин-коррегулируемых пилей адгезии, обеспечивают образование фрагмента, длина которого составляет 167 п.н. [10];

rtxA4-F - 5'-TACTTTAATGGTAACCGCGCT-3'

rtxA4-R2 - 5'-TGTGAACCACGTCTGCT-3' - праймеры на аллель rtxA4 (G⇒A р: 13602 от начала гена) гена rtxA, ответственного за синтез RTX-токсина у V. cholerae биовара Эль Тор, обеспечивают специфическую амплификацию фрагмента ДНК размером 187 п.н. [11];

vc0502 - 5'-CTGTGATTCGGGCTTTATCGG-3'

vc0502-R - 5'-CTTGATGGAGCGGAGAAAAC-3' - праймеры на ген vc0502, кодирующий пили IV-ого типа, с помощью которых образуется фрагмент размером 761 п.н. [12];

vc0514-F - 5'-CTTGATGGAGCGGAGAAAAC-3'

vc0514-R - 5'-CGATGAATAGCCTGTTGAAC-3' - праймеры на ген vc0514, кодирующий синтез метил-акцепторного белка хемотаксиса, обеспечивающие образование фрагмента размером 604 п.н. [12];

Оптимальные концентрации праймеров в составе реакционных смесей были определены экспериментально. Дезоксинуклеотиды dATP, dGTP, dCTP и dTTP взяты в эквимолярном соотношении для достижения конечной концентрации в стоковом растворе dNTP по 2 мМ каждого. Экспериментально подобрано оптимальное соотношение других компонентов для каждой из двух реакционных смесей и общая для них программа амплификации.

Способ осуществляют следующим образом.

1. Выделение ДНК осуществляют с помощью любого комплекта реагентов для выделения ДНК методом нуклеосорбции в присутствии гуанидинизотиоцианата (например, «Набор реагентов для выделения ДНК», рег. уд. № ФСР 2011/11172-280611 производства РосНИПЧИ «Микроб», содержащий водную суспензию нуклеосорбента, буфер 1, включающий гуанидинзотиоцианат и ЭДТА, буферы 2, 3 - для отмывки и элюент для ДНК (ТЕ-буфер). Комплект для выделения ДНК извлекают из холодильника и выдерживают при комнатной температуре. Выделение ДНК проводят согласно инструкции к набору. Очищенную ДНК хранят при температуре +4°С.

2. Для проведения ПЦР готовят необходимое количество микропробирок, соответствующее числу исследуемых проб, а также еще по шесть для каждой реакционной смеси: четыре дифференцирующих положительных контроля и одного отрицательного контроля (деионизированная вода). Полимеразную цепную реакцию проводят в объеме реакционной смеси - 25 мкл на 1 пробу ДНК. Состав реакционной смеси №1 и №2 представлены в таблице 1. В подготовленную смесь вносят по 10 мкл пробы. В пробирку, обозначенную как отрицательный контроль, вносят 10 мкл деионизированной воды, а в пробирки с положительными контролями соответственно по 10 мкл ДНК контрольных штаммов. В качестве положительных контролей используют ДНК токсигенного нового варианта V. cholerae (ctxA⁺ ctxB7⁺ tcpA^CIRS101+ rtxA4⁺ vc0502^- vc0514⁺) и токсигенного типичного/атипичного штамма (ctxA⁺ ctxB7^- tcpA^CIRS101- rtxA4^- vc0502⁺ vc0514⁺).

Амплификацию ДНК осуществляют с использованием программируемого термостата, например «Терцик» (ДНК-Технология, Россия) или аналогичного. ПЦР проводят в один этап по следующей программе: предварительная денатурация при температуре 96°С - 2 мин, 5 циклов, включающих 96°С - 10 с, 58°С - 10 с, 72°С - 30 с; 5 циклов, включающих 96°С - 10 с, 56°С - 10 с, 72°С - 30 с; 25 циклов, включающих 96°С - 10 с, 54°С - 10 с, 72°С - 30 с; заключительная достройка цепи при температуре 72°С - 2 мин (табл. 2).

3. Детекцию амплифицированной ДНК после ПЦР осуществляют методом горизонтального гель-электрофореза в 2% агарозном геле.

Учет результатов ПЦР-анализа проводят путем сравнения полученных ампликонов с контрольными образцами в соответствии с идентификационной таблицей (табл. 3).

С помощью праймеров, содержащихся в первой реакционной смеси, определяют токсигенность (наличие гена ctxA⁺) исследуемых штаммов V cholerae O1 биовара Эль Тор и проводят дифференциацию на типичные/атипичные (ctxB7^- tcpA^CIRS101-/ctxB7^- tcpA^CIRS101+) и новые варианты (ctxB7⁺ tcpA^CIRS101+). Праймеры, входящие в состав второй реакционной смеси, выявляют присутствие в исследуемых штаммах характерных для новых вариантов маркерных генов: аллеля rtxA4, гена vc0514, а также отсутствие гена vc0502.

Принадлежность штаммов V. cholerae O1 биовара Эль Тор к новому варианту определяется по совокупности наличия/отсутствия ампликонов с праймерами к 6 исследуемым ДНК-мишеням.

По наличию ампликонов с праймерами к мишеням ctxA, ctxB7, tcpA^CIRS101, rtxA4, vc0514, но отсутствию таковых к гену vc0502, устанавливают принадлежность штамма к новому варианту возбудителя. Для других токсигенных штаммов характерно присутствие ампликонов с праймерами к гену ctxA, но отсутствию к ctxB7 и разное сочетание ампликонов к другим генам мишеням (табл. 3).

На фиг. 1 приведена электрофореграмма ампликонов, полученных при постановке мультиплексной ПЦР с контрольными штаммами V. cholerae. На дорожках 1 и 6 показано положение ампликонов токсигенного штамма нового варианта Л-3226 V. cholerae O1 биовара Эль Тор, с генами вирулентности ctxA, ctxB7, tcpA^CIRS101, rtxA4 и геном vc0514 делегированного VSP-II. На дорожках 2 и 7 - токсигенного штамма M1293 V. cholerae O1 биовара Эль Тор, содержащего гены ctxA, и vc0502 и vc0514 из интактного VSP-II, но лишенного аллелей ctxB7, tcpA^CIRS101 и rtxA4. На дорожках 3 и 8 - токсигенного штамма М1429 V. cholerae 01 биовара Эль Тор, содержащего гены ctxA, tcpA, rtxA4 и vc0514, но не имеющего аллель ctxB7 гена ctxB, а также vc0502. На дорожках 4 и 9 - токсигенного штамма нового варианта 3265/80 V. cholerae 01 биовара Эль Тор, с генами вирулентности ctxA, ctxB7, tcpA^CIRS101, rtxA4 и геном vc0514 делегированного VSP-II. Дорожка 5 - отрицательный контроль (деионизированная вода). Полученные результаты подтверждены постановкой ПЦР с одиночными праймерами с последующим фрагментарным секвенированием по Сэнгеру полученных продуктов амплификации [13].

Эффективность заявляемого способа идентификации новых вариантов подтверждена на основе ПЦР-анализа 35 природных клинических изолятов (табл. 4), а также использованием дополнительных методов исследования (сравнительный анализ результатов полногеномного секвенирования указанных штаммов).

При тестировании ДНК, выделенной из культур бактерий, не относящихся к виду Vibrio cholerae, специфичные продукты амплификации не образуются, что выражается в отсутствии видимых ампликонов на электрофореграмме. Специфичность заявляемого способа подтверждена по результатам ПЦР-анализа 22 штаммов V. cholerae O139 серогруппы, близкородственных видов - Vibrio mimicus, Vibrio anguillarum, Vibrio parahaemolyticus, а также энтеробактерий - Escherichia coli, Salmonella enteritidis, Shigellaflexneri. Результаты ПЦР тестирования указанных гетерологичных штаммов представлены в табл. 5

Изобретение иллюстрируется следующими примерами:

Пример 1. Исследование подозрительной на принадлежность к V. cholerae культуры, выращенной на плотной питательной среде.

Для исследования используют культуру, подозрительную на принадлежность к виду V. cholerae, выращенную на плотной среде, подходящей для культивирования холерного вибриона (например, 1,5% LB агар, рН 7,6) при 37°С в течение 18 часов. Далее готовят взвесь микробных клеток в физиологическом растворе до концентрации 10⁹ микробных клеток в 1 мл с последующим разведением в деионизированной воде до концентрации 1×10⁷ м.к./мл. После проводят обеззараживание исследуемого образца согласно МУ 1.3. 2569-09. Выделение ДНК исследуемого штамма V. cholerae проводят с помощью коммерческих наборов для выделения ДНК. Полученную ДНК используют для постановки ПЦР с помощью специфичных праймеров на ДНК-мишени ctxA, ctxB7, tcpA^CIRS101, rtxA4, vc0502 и vc0514. Образование на электрофореграмме ампликонов размером 167 п.н., 300 п.н., 564 п.н. в реакционной смеси №1 и 187 п.н., 604 п.н. в реакционной смеси №2 указывает на присутствие в геноме исследуемого штамма генов ctxA, ctxB7, tcpA^CIRS101, rtxA4 и vc0514, но отсутствие гена vc0502. Именно такой набор тестируемых генов характерен для новых генетических вариантов (фиг. 1, табл. 3, табл. 4). Таким образом, эти результаты указывают на принадлежность исследуемого штамма к новым токсигенным вариантам V. cholerae 01 серогруппы биовара Эль Тор.

Пример 2. Исследование бульонной культуры коллекционного штамма возбудителя холеры.

Исследуемый штамм засевают в пробирку с жидкой средой, подходящей для выращивания холерного вибриона (например, LB-бульон), и инкубируют 18 часов при 37°С. Отбирают 100 мкл полученной культуры и проводят подготовку препарата ДНК и постановку мультиплексной ПЦР аналогично примеру №1. Интерпретацию результатов ПЦР проводят согласно таблице 3. Присутствие в геноме исследуемого штамма набора аллелей (ctxA⁺ ctxB7⁺ tcpA^CIRS101+ rtxA4⁺ vc0502^- vc0514⁺) свидетельствует об его принадлежности к токсигенным новым генетическим вариантам V. cholerae O1 серогруппы биовара Эль Тор (фиг. 1, табл. 3, табл. 4).

Список литературы

1. Комплексная гено- и иммунодиагностическая тест-система для идентификации холерных вибрионов O1 и O139 серогруппы и оценки их вирулентности. Патент РФ №2404257, опубликован 20.11.10 г. Бюллетень №32.

2. Смирнова Н.И., Кириллина О.А., Челдышова Н.Б., Кутырев В.В. Дифференциация штаммов Vibrio cholerae eltor по их эпидемической значимости с помощью новых диагностических холерных бактериофагов эльтор ctx- и ctx+ и полимеразной цепной реакции // Журнал эпидемиол., микробиол. и иммунологии. 2001; №6. С. 11-16.

3. Способ идентификации токсигенных штаммов V. cholerae O1, определения их биовара и дифференциации штаммов биовара эльтор на типичные и измененные методом мультиплексной полимеразной цепной реакции и тест-система для его осуществления. Патент РФ №2458141, опубликован 10.08.2012 г. Бюллетень №22.

4. Способ дифференциации штаммов Vibrio cholerae O139 серогруппы по алкилсульфатазной активности. Патент РФ №2473697, опубликован 21.01.2013 г. Бюллетень №3.

5. Способ выявления эпидемически значимых холерных вибрионов Vibrio cholerae eltor и Vibrio cholerae O139 по их адгезивной способности. Патент РФ №2332460, опубликован 27.08.2008 г. Бюллетень №24.

6. Способ одновременной идентификации токсигенных штаммов геновариантов возбудителя холеры Эль Тор и их дифференциации по эпидемическому потенциалу методом мультиплексной полимеразной цепной реакции. Патент РФ №2560280, опубликован 20.08.2015 г. Бюллетень №35.

7. Способ идентификации штаммов Vibrio cholerae O1, определения их токсигенности и биовара с дифференциацией биовара ЭльТор на типичные и генетически измененные варианты методом мультиплексной полимеразной цепной реакции и тест-система для его осуществления с учетом результатов в режиме "реального времени". Патент РФ №2732448, опубликован 16.09.2020 г. Бюллетень №15.

8. Fields P.I., Popovic Т., Wachsmuth K., Olsvik О. Use of polymerase chain reaction for detection of toxigenic Vibrio cholerae O1 strains from the Latin American cholera epidemic // Journal of clinical microbiology. 1992; V. 30(8). P. 2118-2121.

9. Naha A., Pazhani G.P., Ganguly M., Ghosh S. et al. Development and evaluation of a PCR assay for tracking the emergence and dissemination of Haitian variant ctxB in Vibrio cholerae O1 strains isolated from Kolkata, India // Journal of clinical microbiology. 2012; V. 50(5). P. 1733-1736.

10. Ghosh P., Naha A., Basak S., Ghosh S. et al. Haitian variant tcpA in Vibrio cholerae O1 El Tor strains in Kolkata, India // Journal of clinical microbiology. 2014; V. 52(3). P. 1020-1021.

11. Ghosh P., Naha A., Pazhani G.P., Ramamurthy T. et al. Genetic traits of Vibrio cholerae O1. Haitian isolates that are absent in contemporary strains from Kolkata, India // PloS one. 2014; V. 9(11): el 12973.

12. Агафонов Д.А., Заднова С.П., Лозовский Ю.В., Смирнова Н.И. Конструирование ПЦР тест-системы для дифференциации генетически измененных токсигенных штаммов Vibrio cholerae биовара Эль Тор с разным эпидемическим потенциалом // Пробл. особо опасных инф. 2014;. Вып. 2(119). С. 85-88.

13. Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1977; V. 74(12). P. 5463-5467.

Перечень последовательностей праймеров

SEQ ID NO: 1

- ctxB7-F3 - 5'-GTTTTACTATCTTCAGCATATGCGA-3',

- ctxB7-R - 5'-ATCGCATGAGGCGTTTTATT-3',

SEQ ID NO: 2

- tcpA-F2 - 5'-CCAGCTACCGCAAACGCAGG-3'

- tcpA-Rev - 5'-CCGACTGTAATTGCGAATGC-3',

SEQ ID NO: 3

- rtxA4-F - 5'-TACTTTAATGGTAACCGCGCT-3',

- rtxA4-R2 - 5'-TGTGAACCACGTCTGCT-3',

SEQ ID NO: 4

- vc0502-F - 5'-CTGTGATTCGGGCTTTATCGG-3',

- vc0502-R - 5'-CTTGATGGAGCGGAGAAAAC-3',

SEQ ID NO: 5

- vc0514-F - 5'-CTTGATGGAGCGGAGAAAAC-3',

- vc0514-R - 5'-CGATGAATAGCCTGTTGAAC-3',

SEQ ID NO: 6

- ctxA-F - 5'-CGGGCAGATTCTAGACCTCCTG-3',

- ctxA-R - 5'-CGATGATCTTGGAGCATTCCCAC-3'

Формула изобретения

Способ идентификации токсигенных генетических вариантов возбудителя холеры Эль Тор с набором мутаций в генах вирулентности и генах острова пандемичности VSP-II методом мультиплексной полимеразной цепной реакции, предусматривающий подготовку и обеззараживание исследуемых проб, выделение ДНК и проведение мультиплексной ПЦР в один прием в двух реакционных смесях, первая из которых содержит специально подобранное сочетание праймеров SEQ ID NO: 1, 2, 6 на ДНК-мишени ctxA, ctxB7, tcpA^CIRS101, вторая смесь включает SEQ ID NO: 3, 4, 5 на ДНК-мишени rtxA4, vc0502 и vc0514, с последующей идентификацией токсигенных новых вариантов по наличию ампликонов к пяти мишеням - ctxA, ctxB7, tcpA^CIRS101, rtxA4, vc0514 и отсутствию ампликона к мишени vc0502.