РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА ПО ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ

(19) RU (11) 2 856 143 (13) C1 (51) МПК C07K 14/725 (2006.01) C12N 5/0783 (2010.01)

(54) Способ получения Т-клеточного рецептора человека, способного распознавать эпитоп HER2/neu (ERBB2) (369-377, KIFGSLAFL) в комплексе с HLA-A*02

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к иммунологии, и направлено на получение конструкции кодирующей последовательность Т-клеточного рецептора (TCR), распознающего антигенный эпитоп белка HER2/neu и способная индуцировать антиген-специфическое уничтожение клетки-мишени с экспрессией HER2/neu.

В структуре смертности населения России злокачественные новообразования занимают второе место (15,4%) после болезней системы кровообращения. Ведущими локализациями злокачественных опухолей у обоих полов являются кожа (12,3%, с меланомой - 14,0%), молочная железа (11,4%), трахея, бронхи, легкое (10,5%), желудок (7,0%). При этом, ведущей онкологической патологией у женского населения является рак молочной железы (20,9%), уровень смертности от которого занимает первое место (17,0%) (Под ред. А.Д. Каприна, В.В. Старинского, Г.В. Петровой Злокачественные новообразования в России в 2013 году (заболеваемость и смертность) М.: ФГБУ «МНИОИ им. П.А. Герцена» Минздрава России. - 2015. илл. 250 с.).

Общепринятыми методами лечения рака на сегодняшний день являются хирургия, лучевая терапия и химиотерапия. Использование данных методов позволяет эффективно снижать опухолевую нагрузку за короткий период времени, но не дает возможности элиминировать все опухолевые клетки, диссеминированные в организме пациента. Минимальная опухолевая нагрузка, сохраняющаяся после удаления основной части новообразования, является причиной возникновения рецидивов опухоли и развития метастазов, что в свою очередь приводит к повышению уровня смертности и инвалидизации пациентов с онкологическими заболеваниями.

Таким образом, традиционные подходы к лечению рака обнаруживают недостатки в вопросе устранения минимальной опухолевой нагрузки, и становится очевидной необходимость появления новых технологий, направленных на улучшение процессов распознавания и уничтожения единичных опухолевых клеток, оставшихся в организме пациента после проведения лучевой терапии, химиотерапии или хирургического удаления основной массы опухоли.

Фундаментальные и клинические исследования последних лет подтверждают, что использование потенциала иммунной системы может быть весьма перспективным для устранения опухолевых клеток (Palucka K., Ueno Н., Banchereau J. Recent developments in cancer vaccines. // JImmunol. - 2011. - Vol. 186. - №3. - P. 1325-31; Qian X., Wang X., Jin H. Cell transfer therapy for cancer: past, present, and future. // JImmunolRes. - 2014. doi: 10.1155/2014/525913). Иммунотерапевтические подходы позволяют активировать клеточное звено иммунитета, направляя специфический иммунный ответ против опухолевых клеток, несущих на своей поверхности опухолевые антигены, не повреждая здоровые клетки. Учитывая вышесказанное, целесообразна разработка подходов, позволяющих эффективно генерировать специфический противоопухолевый иммунный ответ в организме пациента.

На настоящий момент разработано несколько различных иммунотерапевтических подходов, направленных против различных форм опухолей молочной железы и яичников, экспрессирующих ERBB2. Иммунотерапия на основе антител против ERBB2, такая как моноклональные антитела трастузумаб, может использоваться для лечения пациентов с раком молочной железы со сверхэкспрессией ERBB2, но этот подход не оказался столь же эффективным у пациентов с раком яичников (Bookman M.A., Darcy K.M., Clarke-Pearson D., Boothby R.A., Horowitz I.R. Evaluation of monoclonal humanized anti-HER2 antibody, trastuzumab, in patients with recurrent or refractory ovarian or primary peritoneal carcinoma with overexpression of HER2: a phase II trial of the Gynecologic Oncology Group. J Clin. Oncol. 2003 Jan 15;21(2):283-90. doi: 10.1200/JCO.2003.10.104).

Другой иммунотерапевтический подход заключается в создании изолированных рецепторов Т-клеток (TCR), обладающих высокой аффинностью и специфически связывающий эпитоп ERBB2 (369-377) на клетке-мишени. Другие варианты реализации включают Т-клетку или популяцию Т-клеток, модифицированную для экспрессии ERBB2-специфического TCR. Дополнительные варианты реализации включают способы использования переноса гена TCR, специфичного для ERBB2, для лечения раковых клеток, экспрессирующих ERBB2. Также включены способы и фармацевтические композиции, содержащие модифицированные Т-клетки, для адоптивной терапии (US10414812, C07K4/725, 2018; US11345735, С07К14/47, 2020).

Основную роль в развитии специфического противоопухолевого иммунного ответа играют цитотоксические Т-лимфоциты. Наличие противоопухолевых цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ), как в отношении их количества, так и нормального функционирования, является необходимым условием для уничтожения опухолевых клеток иммунной системой (Aerts J., Hegmans J. Tumor-specific cytotoxic T cells are crucial for efficacy of immunomodulatory antibodies in patients with lung cancer. // Cancer Res. - 2013. - Vol. 73. - P. 2381-2388). Иммунотерапевтические подходы, направленные на борьбу с конкретными опухоль-ассоциированными антигенами, также используют активированные антиген-специфические цитотоксические Т-лимфоциты в качестве главного противоопухолевого агента.

Известен способ получения in vitro популяций активированных антигенспецифических противоопухолевых цитотоксических Т-лимфоцитов, специфичных к эпитопам опухоль-ассоциированного антигена, включающий получение прилипающей и неприлипающей фракции мононуклеарных клеток (МНК), выделенных из периферической крови человека, получение дендритных клеток (ДК) путем стимуляции их дифференцировки из прилипающей фракции МНК и антигенную активацию полученных зрелых ДК опухоль-ассоциированным антигеном, совместное культивирование клеток из неприлипающей фракции с аутологичными зрелыми антиген-активированными ДК из прилипающей фракции, последующее выделение фракции антигенспецифических Т-лимфоцитов с помощью окрашивания антигенспецифическими реагентами, стимуляцию роста выделенных цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) с использованием рекомбинантного человеческого интерлейкина-2 (рчИЛ-2), интерлейкина-7 (рчИЛ-7) и интерлейкина-15 (рчИЛ-15), отличающийся тем, что антигенную активацию полученных зрелых ДК осуществляют с использованием ДНК-конструкции, кодирующей эпитопы KIFGSLAFL и RLLQETELV опухоль-ассоциированного белка HER2, совместному культивированию с аутологичными зрелыми антиген-активированными ДК из прилипающей фракции подвергают все клетки неприлипающей фракции МНК, далее из совместной культуры ДК и МНК выделяют цитотоксические Т-лимфоциты, специфичные к эпитопам KIFGSLAFL и RLLQETELV белка HER2 методом магнитной сепарации с использованием антигенспецифических реагентов, обеспечивающих обратимое окрашивание выделяемых клеток, а после выделения HER2-специфических ЦТЛ производят стимуляцию их пролиферации посредством культивирования в присутствии внесенных одновременно цитокинов рчИЛ-2, рчИЛ-7, рчИЛ-15 в течение 14-20 суток, причем конечная концентрация каждого из цитокинов рчИЛ-2, рчИЛ-7 и рчИЛ-15 составляет 50 нг/мл. В качестве окрашивающего антигенспецифического реагента используют стрептамеры (RU 2619186, C12N5/0783, 2017).

Недостатком способа является необходимость получения дополнительно культуры дендритных клеток, их трансфекция и их сокультивирования, а также необходимость использования антигенспецифических реагентов (стрептомеров) для выделения HER2/neu-специфических цитотоксических Т-лимфоцитов, что значительно удлиняет время получения антиген-специфических цитотоксических Т-лимфоцитов и могут негативно влиять эффективность генерации in vitro популяций антигенспецифических цитотоксических Т-клеток с активностью против опухолевых клеток.

Наиболее близким является способ получения человеческого Т-клеточного рецептора, специфичного к эпитопу 369-377, полученного из белка рецептора HER2/neu (ERBB2), включающий выделение мононуклеарных клеток периферической крови HLA-A02-позитивных пациенток, больных раком молочной железы, из которых культивируют зрелые дендритные клетки, содержащие пептиды, полученные из ERBB2; введение полученной аутологичной дендритноклеточной вакцины HLA-A02+пациенткам с ERBB2-позитивными опухолями молочной железы; затем у этих пациенток посредством лейкофереза и элютриации выделяют моноциты и культивируют в присутствии 500 МЕ/мл рекомбинантного человеческого гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF) и 250 МЕ/мл интерлейкина-4 (IL-4) в течение четырех дней; а на 5-й день в культуру добавляют 1000 единиц/мл IFN-γ с последующей инкубацией в течение 16-18 часов при температуре 37°C; на 6-й день добавляют липополисахарид (LPS) в концентрации 10нг/мл в течение 6 часов для завершения созревания дендритных клеток; после чего в течение 2 часов вводили HLA-связывающий пептид, специфичный для ERBB2(369-377), затем полученные дендритные клетки собирают, промывают питательной средой, подсчитывают количество дендритных клеток, оценивают их жизнеспособность и сокультивируют с аутологичными очищенными на колонке CD8-позитивными Т-клетками, полученные после вакцинации в соотношении 10:1, а на 2-й день в совместную культуру добавляют IL-2 (50 МЕ/мл) и через 7 дней сокультивирования CD8+ Т-клетки выделяют с помощью тетрамер HLA-A02/ERBB2(369-377), затем оценивают эффекторные функции ERBB2-специфичных Т-клеток при сокультивировании с HLA-A2-позитивными T2 клетками, предварительно нагруженных пептидом ERBB2(369-377). Если CD8-позитивные Т-клетки демонстрировали высокую продукцию пептид-специфического IFN-γ при совместном культивировании с антигенпрезентирующими клетками, нагруженными соответствующим пептидом ERBB2, тогда Т-клетки анализируют для исследования последовательности генов TCR. Для идентификации последовательностей генов TCR проводят с помощью 5'-RACE-PCR (ПЦР) амплификацию вариабельной области цепей TCRα и TCRβ, включая CDR3, с РНК, выделенной из клонов Т-клеток. Затем продукты RACE-PCR секвенируют. Цепи TCRα и TCRβ соединяют пептидным линкером 2A в виде TCRb-P2A-TCRa, а полные конструкции клонируют в скелет вектора ретровирусной векторной плазмиды pMSGV1, производного вектора pMSGV (сплайсинг на основе вируса стволовых клеток мыши (MSCV)-gag вектор), который использует длинный концевой повтор MSCV (LTR) (Cohenet al., J.Immunol 175, 5799-5808, 2005). Для определения репертуара α-цепи вариабельной области TCR (TCRV) и репертуар β-цепи TCRV захваченных ERBB2-специфичных Т-клеток, из отсортированных клеток выделяют тотальную РНК и подвергали 5'-RACE-PCR (ПЦР). Двадцать три отдельных клона кДНК α-цепи и четырнадцать отдельных клонов кДНК β-цепи были полностью секвенированы в результате двух независимых реакций ПЦР. Данные о последовательностях продемонстрировали две относительно доминантные последовательности в репертуаре TCRVβ, которые принадлежали семейству β-цепей BV3-1(9S1). Большая гетерогенность наблюдалась в репертуаре TCRV α: по два повтора для α-цепей AV3 и AV12 (US2022332787A1, C07K 14/725, 2022).

Недостатком прототипа является необходимость предварительной дендритноклеточной вакцинации больных раком молочной железы, которая может продолжатся до 6 месяцев и полученные результаты варьируются у разных пациентов в зависимости от тяжести болезни и стадии противоопухолевой терапии; недостатком также является то, что для анализа антиген-специфические Т-клетки выделяли тетрамерами, что затрудняет получение чистой культуры эффекторных клеток; информация о антиген-специфических TCR Т-клеточных рецепторах представлена лишь в виде его составных элементов (альфа- и бета-цепи по отдельности), что не отражает строение конкретного TCR-T клеточного рецептора, так как альфа- и бета-цепи, из которых в прототипе создают Т-клеточный рецептор, могут изначально принадлежать двум разным Т-клеточным рецепторам, из-за чего возможны серьезные побочные эффекты. Кроме того, противоопухолевая активность TCR-T клеток оценивается по продукции IFN-γ, которая является косвенным показателем и отражает в целом активацию Т-клеточного звена иммунитета, и она может быть не связана с антиген-специфическим противоопухолевым иммунным ответом. Данные недостатки не позволяют получить истинную информацию о строении и аффинитете человеческого Т-клеточного рецептора к эпитопу HER-2/neu.

Задачей изобретения является получения в короткий срок точной информации о человеческом Т-клеточном рецепторе, специфичного эпитопу HER2/neu (ERBB2) 369-377, KIFGSLAFL в комплексе с HLA-A*02.

Поставленная задача решается тем, что в способе получения человеческого Т-клеточного рецептора, специфичного к эпитопу HER2/neu (ERBB2) 369-377, KIFGSLAFL в комплексе с HLA-A*02, включающий выделение мононуклеарных клеток (МНК) периферической крови HLA-A02-позитивных доноров, их последующее разделение на прилипающую и неприлипающую фракции посредством адгезии на пластике в течение 30 минут при +37°С в условиях СО₂-инкубатора, затем прилипающую фракцию МНК культивируют в присутствии рекомбинантного человеческого гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF) и интерлейкина-4 (IL-4) в течение четырех дней для получения дендритных клеток; на 5-й день в культуру дендритных клеток добавляют в качестве фактора праймирования эпитоп HER2/neu (ERBB2) 369-377, KIFGSLAFL с последующей их инкубацией при температуре 37°C; на 6-й день добавляют фактор созревания для завершения созревания дендритных клеток; затем полученные дендритные клетки собирают, промывают питательной средой, подсчитывают количество дендритных клеток, оценивают их жизнеспособность и сокультивируют с аутологичными CD8-позитивными Т-лимфоцитами, полученными из неприлипшей фракции МНК, в определенном соотношении, а через 7 дней сокультивирования выделяют антиген-специфические CD8-позитивные T-клетки, затем производят идентификацию последовательности генов TCR и амплификацию вариабельной области цепей TCRα и TCRβ, включая CDR3, выделенной из клонов Т-клеток, при этом цепи TCRα и TCRβ соединяют пептидным линкером 2A в виде TCRb-P2A-TCRa, а полную конструкцию TCR клонируют в скелет вирусной плазмиды для получения комплексов TCR, содержащие клоны кДНК α-цепи и β-цепи, причем донорами являются условно-здоровые индивидуумы, из крови которых моноциты выделяли на градиенте фиколла, на 5-й день добавляют в качестве фактора праймирования эпитоп HER2/neu (ERBB2) 369-377, KIFGSLAFL в дозе 30 мкг/мл и последующей инкубацией в течение 24 часов, на 6-й день в качестве фактора созревания добавляют TNF-α в концентрации 25 нг/мл в течение 24 часов, а сокультивирование дендритных клеток осуществляется с CD8-позитивными Т-лимфоцитами в присутствии 0,5 мкг/мл антител к CD3, 1 мкг/мл антител к CD28 и по 10 нг/мл IL-2, по 10 нг/мл IL-7, по 10 нг/мл IL-15 в соотношении 1:10, через 7 дней сокультивирования выделяют антиген-специфические CD8-позитивные T-клетки с помощью реагентов Flex-T, затем производят идентификацию последовательности генов TCR с помощью секвенирования РНК единичных клеток (Single-cell RNA sequencing (scRNA-seq)) и выбор клона TCR специфичного к эпитопу HER2/neu (ERBB2) 369-377, KIFGSLAFL, с помощью нейросетей ERGO-II и программы ClonoSort, помимо соединения цепи TCRα и TCRβ пептидным линкером 2A в виде TCRb-P2A-TCRa используют нетранслируемую область бета-глобулина на 5' и 3' концах вставки, в качестве вирусной плазмиды используют лентивирус на основе ВИЧ-1 в виде pLentihPGK, получают один доминирующий TCR с одной альфа- и одной бета-цепью, происходящими из одной и той же клетки.

Существенным в данном способе является получение в короткий срок более точной информации о строении человеческого Т-клеточного рецептора, специфичного для эпитопа HER2/neu (ERBB2) 369-377, KIFGSLAFL в комплексе с HLA-A*02.

Это достигается, в частности, использованием более точного метода анализа РНК клеток (секвенирование РНК единичных клеток), позволяющего получить полную информацию о строении конкретного Т-клеточного рецептора (α-цепи и β-цепи) на каждой отдельной клетке и использующего для этого значительно меньшее количество целевых клеток, что позволяет получать необходимую информацию используя биологический материал доноров. Данный метод позволяет не проводить дополнительные процедуры (вакцинация доноров клетками, нагруженные целевым антигеном, и длительное культивирование исследуемых клеток для получения необходимого количества) и сократить время получение Т-клеточного рецептора. Использование нейросетей ERGO-II и инструмент TCRscape для одновременного мультимодального анализа экспрессии генов и клонотипа отдельных Т-клеток, профилированных с помощью системы BD Rhapsody [https://github.com/Perik-Zavodskii/TCRscape]; позволяет выбрать клон TCR для антигена HER2/neu, обладающего высоким аффинитетом к целевому пептиду и минимальным аффинитетом к нецелевым пептидам. Использование Flex-T, который является более специфичным методом обнаружения антиген-специфических клеток.

Способ осуществляется следующим образом.

1. Получение антиген-специфических Т-клеток.

Мононуклеарные клетки (МНК) получают из периферической крови условно-здоровых доноров с генотипом HLA-A02. МНК разделяют на прилипающую и неприлипающую фракции посредством адгезии на пластике в течение 30 минут при +37°С в условиях СО₂-инкубатора. Получение зрелых дендритных клеток (ДК) из прилипающей фракции проводили с использованием GM-CSF (100 нг/мл) и IL-4 (50 нг/мл). Для нагрузки антигеном использовали пептид p369-377 (KIFGSLAFL), полученный из белка рецептора HER2/neu, в дозе 30 мкг/мл пептида на 5 сутки культивирования, с последующим созреванием ДК с помощью TNF-alpha (25 нг/мл) на 6 сутки культивирования. Клетки неприлипшей фракции МНК были культивированы в течении 6 суток. На 7 день проводилось объединение культур ДК и неприлипшей фракции МНК (соотношение 1:10) с добавлением 0,5 мкг/мл анти-CD3, 1 мкг/мл анти-CD28 и по 10 нг/мл IL-2, по 10 нг/мл IL-7, по 10 нг/мл IL-15 для поддержания жизнеспособности и пролиферации CD8+ цитотоксических Т-лимфоцитов. Через 7-8 дней совместного культивирования проводили выделение антиген-специфических Т-клеток из совместной культуры ДК и неприлипших МНК с помощью реагентов Flex-T и соответствующих пептидов с одновременным окрашиванием позитивных специфических клеток двумя флюорохромами для идентификации методом проточной сортировки.

После завершения полного цикла протокола по получению антиген-специфических Т-клеток было получено два образца специфичных к эпитопу HER2/neu (ERBB2) 369-377, KIFGSLAFL. Оценка жизнеспособности клеток проводилась с использованием красителей 7AAD и кальцеина, при этом доля 7AAD-негативных и кальцеин-позитивных клеток составляла не менее 80%. Для последующего анализа на платформе BD Rhapsody, предназначенной для мультиомного исследования единичных клеток, полученные клетки были помечены антителами SampleTag, обеспечивающими мультиплексирование биологических образцов.

25 000 меченых Т-клеток были загружены в станцию BD Rhapsody Express, где проводились ключевые этапы подготовки образцов. К клеткам добавляли металлические бусы, несущие молекулярные штрихкоды и последовательности для захвата поли-А-несущие молекул (мРНК, включая α- и β-цепи T-клеточного рецептора (TCR), а также SampleTag), после чего осуществлялись лизис клеток и гибридизация поли-А-несущих молекул с бусами. Затем происходила обратная транскрипция, приводящая к синтезу кДНК, после чего добавляли Template Switch Oligo (TSO) и выполняли дополнительный раунд обратной транскрипции, обеспечивающий возможность прочтения с 5’-конца кДНК.

Для усиления сигнала кДНК амплифицировали в двухраундовой полугнездовой ПЦР. В дальнейшем, для создания библиотеки TCR, применяли случайный отжиг праймеров и элонгацию. Финальные библиотеки иммунного транскриптома (379 генов, связанных с иммунным ответом), TCR и SampleTag формировали путем гнездовой ПЦР для продуктов второй полугнездовой ПЦР библиотек SampleTag и иммунного транскриптома и продуктов случайного отжига и элонгации библиотеки TCR , используя праймеры с адаптерами для секвенирования на платформе Illumina. Библиотеки объединяли в пул, рассчитанный на 25 000 загруженных клеток, с глубиной секвенирования 10 000 прочтений на клетку для иммунного транскриптома, 15 000 для TCR и 1 200 для SampleTag. Окончательное секвенирование проводили на платформе NovaSeq 6000 с использованием ячейки S2 и парного прочтения (150 п.н.).

Сгенерированные FASTQ-файлы были проанализированы с использованием пайплайна BD версии 1.11.1L, который выполняет комплексную обработку данных. В ходе анализа проводился контроль качества прочтений, их выравнивание на референсный транскриптом, включая последовательности T-клеточных рецепторов. Далее формировались библиотеки клеточных индексов, а для коррекции ПЦР-артефактов применялись алгоритмы UMI RSEC (unique molecular identifier recursive substitution error correction, уникальный молекулярный идентификатор, исправление ошибок рекурсивной замены) и UMI DBEC (unique molecular identifier distribution-based error correction, коррекция ошибок на основе распределения уникальных молекулярных идентификаторов). Дополнительно выполнялась очистка данных от технического шума посредством анализа второй производной. В результате получены финальные матрицы генной экспрессии, а также данные о составе TCR-репертуара в формате Adaptive Immune Receptor Repertoire (AIRR), содержащие последовательности α- и β-цепей T-клеточных рецепторов.

В ходе эксперимента было получено 7100 единичных клеток. Оценка вероятности связывания Т-клеточного рецептора с комплексом пептид/MHC проводилась с использованием нейросетевого алгоритма ERGO-II. Для анализа выполнялась загрузка репозитория модели, после чего инструмент запускался через терминал с указанием входного файла и базы данных McPAS, на основе которой была обучена нейросеть. McPAS-TCR представляет собой вручную курируемую базу данных, основанную на опубликованных исследованиях и содержащую информацию о приблизительно 40 000 последовательностях Т-клеточных рецепторов, их антигенных мишенях, типе Т-клеток (CD4⁺/CD8⁺), а также классе MHC (MHC-I или MHC-II). В базе собраны данные о Т-лимфоцитах, экспансирующихся в ответ на различные патологические состояния у человека и мыши, включая вирусные инфекции, онкологические заболевания и аутоиммунные реакции.

Для запуска ERGO-II входной CSV-файл содержал последовательности CDR3α и CDR3β TCR, аминокислотную последовательность пептида, информацию о классе MHC, V- и J-генах, а также типе Т-клеток (CD4- или CD8-позитивные). В результате анализа формировался выходной файл, содержащий нормализованную оценку вероятности связывания TCR с комплексом пептид/MHC (score), варьирующуюся от 0 до 1, где 0 соответствует минимальной, а 1 - максимальной оценке. Для дальнейшего изучения были отобраны клоны с нормализованной оценкой выше 0.5.

Затем импортировали матрицы экспрессии генов каждого биологического образца и прогнозируемую вероятность связывания TCR с комплексным пептид/МНС в дополнение к матрице репертуара адаптивных иммунных рецепторов (AIRR) в инструмент TCRscape для одновременного мультимодального анализа экспрессии генов и клонотипа отдельных Т-клеток, профилированных с помощью системы BD Rhapsody [https://github.com/Perik-Zavodskii/TCRscape]; после этого определили клонотипы Т-клеточных рецепторов, которые присутствовали в 2 и более клетках и выполнили нормализацию по логарифму 2 (количество на миллион CPM) для объединенной матрицы и подсчитали полный-длина TCR-клонотипов; затем мы выполнили анализ главных компонент (PCA) для объединенной матрицы, чтобы оценить размерность данных с последующим использованием равномерной аппроксимации многообразия и уменьшения размерности проекции (UMAP) для интеграции данных о клонотипе с прогнозируемой вероятностью связывания и данными об экспрессии генов. После этого мы сгруппировали клетки с помощью DBSCAN.

Для эпитопа HER2/neu обнаружено около 100 клонотипов. Нами был выбран HER2/neu TCR с вероятностью связывания 0.546, который был использован для создания лентивирусной конструкции.

Далее был сконструирован лентивирусный вектор на основе ВИЧ-1 в виде pLenti_hPGK_gfp, в котором вместо гена EGFP была встроена целевая вставка (схема плазмиды pLenti_hPGK_gfp представлена на фиг. 1. Данный вектор использовали для получения TCR-T-клеток, специфичных к эпитопу HER2/neu (ERBB2) (369-377, KIFGSLAFL).

В трансферную плазмиду лентивирусного вектора были интегрированы последовательности TCRα и TCRβ, организованные в единую открытую рамку считывания, разделённые посредством сигнала сброса полипептида P2A, который обеспечивает разделение полипептидных цепей во время трансляции. Схема конструкции вставки представлена на фиг. 2.

Трансферная плазмида, плазмида, кодирующая VSV-G, и упаковочные плазмиды лентивируса третьего поколения были наработаны в клетках E. coli (штамм NEB Stable), после чего проверены методом рестрикционного анализа с последующей гель-электрофорезной валидацией. Эти плазмиды были доставлены в упаковочные клетки HEK-293T с использованием липофектамина 2000/3000 для последующего производства лентивирусных частиц.

Полученные лентивирусы концентрировали с использованием коммерческого набора TransLv™ Lentivirus Precipitation Solution (5×), а их титрование проводили количественной ПЦР (qPCR) с применением стандартизированного метода детекции провирусной ДНК (TransLv™ Lentivirus qPCR Titration Kit) в клетках HEK-293T. Для оптимизации трансдукции в целевые T-клетки была определена наиболее подходящая множественность инфекции (Multiplicity of Infection, MOI), обеспечивающая максимальную эффективность трансдукции и жизнеспособность клеток при минимальной экспрессии маркеров истощения.

Т-клетки-мишени подвергали трансдукции полученными лентивирусными частицами при оптимальном MOI, после чего выполняли сортировку CD8-позитивных клеток. Оценку цитотоксической активности трансдуцированных TCR-Т-клеток проводили в условиях сокультивирования с опухолевыми клеточными линиями в соотношении 1:10. В эксперименте использовали клетки, различающиеся по экспрессии HER2/neu: SK-MeL-5 и SK-Mel-37 (MHC-I-позитивные с высокой экспрессией HER2/neu) и HCT-116 (MHC-I-позитивные с низкой экспрессией HER2/neu). В качестве контроля использовали нетрансдуцированные Т-клетки.

На фиг. 3 показан процент гибели опухолевых клеток линии SK-MeL-5 и SK-Mel-37 с высокой экспрессией HER2/neu и линии HCT-116 с низкой экспрессией HER2/neu (контроль) при сокультивировании их с CD8-позитивнымиТ-клетками, трансдуцированные лентивирусной конструкцией, кодирующей TCR-T клеточный рецептор к эпитопу HER2/neu (ERBB2) 369-377, KIFGSLAFL.

Таким образом, предложенный способ получения человеческого Т-клеточного рецептора, специфичного для эпитопа HER2/neu (ERBB2) 369-377, KIFGSLAFL позволяет создать в короткий срок, без дополнительных длительных процедур (получение дендритноклеточных вакцин, вакцинация доноров), и имеющее точное описание строения T-клеточного рецептора, специфичного для эпитопа HER2/neu (ERBB2) 369-377, KIFGSLAFL. Проведенные исследования in vitro CD8-позитивных клеток, трансдуцированных лентивирусной конструкцией, кодирующей разработанный клеточный рецептор к эпитопу HER2/neu (ERBB2) 369-377, KIFGSLAFL, показали высокий показатель цитотоксичности против опухолевых клеток, экспрессирующих антиген HER2/neu, в отличие от соответствующего контроля.

Формула изобретения

Способ получения Т-клеточного рецептора человека, способного распознавать эпитоп HER2/neu (ERBB2) 369-377, KIFGSLAFL, в комплексе с HLA-A*02, включающий выделение мононуклеарных клеток (МНК) периферической крови HLA-A02-позитивных доноров, их последующее разделение на прилипающую и неприлипающую фракции посредством адгезии на пластике в течение 30 мин при +37°С в условиях СО₂-инкубатора, затем прилипающую фракцию МНК культивируют в присутствии рекомбинантного человеческого гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF) и интерлейкина-4 (IL-4) в течение четырех дней для получения дендритных клеток; на 5-й день добавляют в качестве фактора праймирования эпитоп HER2/neu (ERBB2) 369-377, KIFGSLAFL, в культуру дендритных клеток с последующей их инкубацией при температуре 37°C; на 6-й день добавляют фактор созревания для завершения созревания дендритных клеток; затем полученные дендритные клетки собирают, промывают питательной средой, подсчитывают количество дендритных клеток, оценивают их жизнеспособность и сокультивируют с аутологичными CD8-позитивными T-лимфоцитами, полученными из неприлипшей фракции МНК, в определенном соотношении, а через 7 дней сокультивирования выделяют антиген-специфические CD8-позитивные T-клетки, затем производят идентификацию последовательности генов TCR и амплификацию вариабельной области цепей TCRα и TCRβ, включая CDR3, выделенной из клонов Т-клеток, при этом цепи TCRα и TCRβ соединяют пептидным линкером 2A в виде TCRb-P2A-TCRa, а полную конструкцию TCR клонируют в скелет вирусной плазмиды для получения комплексов TCR, содержащих клоны к ДНКα-цепи и β-цепи, отличающийся тем, что донорами являются условно-здоровые индивидуумы, из крови которых моноциты выделяли на градиенте фиколла, на 5-й день добавляют в качестве фактора праймирования эпитоп HER2/neu (ERBB2) 369-377, KIFGSLAFL, в дозе 30 мкг/мл и последующей инкубацией в течение 24 ч, на 6-й день в качестве фактора созревания добавляют TNF-a в концентрации 25 нг/мл в течение 24 ч, а сокультивирование дендритных клеток осуществляют с CD8-позитивными T-лимфоцитами в присутствии 0,5 мкг/мл антител к CD3, 1 мкг/мл антител к CD28 и 10 нг/мл IL-2, 10 нг/мл IL-7, 10 нг/мл IL-15 в соотношении 1:10, через 7 дней сокультивирования выделяют антиген-специфические CD8-позитивные T-клетки с помощью реагентов Flex-T, затем производят идентификацию последовательности генов TCR с помощью секвенирования РНК единичных клеток (Single-cell RNA sequencing (scRNA-seq)) и выбор клона TCR, специфичного к эпитопу HER2/neu (ERBB2) 369-377, KIFGSLAFL, с помощью нейросети ERGO-II и инструмента TCRscape, причем помимо соединения цепи TCRα и TCRβ пептидным линкером 2A в виде TCRb-P2A-TCRa используют 5' и 3' нетранслируемые области бета-глобулина на 5' и 3' концах вставки, в качестве вирусной плазмиды используют лентивирус на основе ВИЧ-1 в виде pLentihPGK, получают TCR с одной альфа- и одной бета-цепью, происходящими из одной и той же клетки.