РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА ПО ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ

(19) RU (11) 2 845 693 (13) C1 (51) МПК C12N 1/00 (2006.01)

(54) Штамм Cupriavidus necator - продуцент разрушаемых полигидроксиалканоатов на жировых отходах рыбопереработки

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к штамму Cupriavidus necator ВКПМ B-15081 (C. necator B-15081), который может быть использован для получения разрушаемых «зеленых» пластиков - микробных полигидроксиалканоатов (ПГА), перспективных для широкого применения в различных областях. Штамм обладает высокой липазной активностью, активно метаболизирует жировые субстраты, обеспечивая высокие выходы ПГА при высокой степени использования жиросодержащих субстратов, полученных из отходов рыбопереработки. Штамм способен синтезировать ПГА различного химического состава, включая менее кристалличные технологичные сополимеры, которые содержат, помимо мономеров 3-гидроксибутирата (3ГБ), мономеры 3-гидроксивалерата (3ГВ) и 4-гидроксибутирата (4ГБ) при добавках в культуру дополнительных субстратов-предшественников.

ПГА - это семейство биоразрушаемых термопластичных полимеров различного химического строения с высокими потребительскими свойствами, включая высокую биологическую совместимость, разрушаемость в природных средах, возможность переработки в изделия из различных фазовых состояний доступными методами и перспективны для применения- от коммунального и сельского хозяйства до фармакологии и биомедицины. Ключевая проблема для наращивания объемов производства и расширения сфер применения ПГА- снижение стоимости. В структуре затрат на производства ПГА до 45-50% приходится на стоимость углеродного субстрата. Поэтому привлечение доступных новых субстратов включая отходы - актуальная проблема биотехнологии полигидроксиалканоатов.

Известны природные и генетически сконструированные штаммы различных таксонов, способные использовать для синтеза ПГА различные углеродные субстраты различной степени восстановленности и стоимости, - индивидуальные соединения (сахара, органические кислоты, спирты, метан, углекислота и ее смеси с водородом и кислородом, глицерин и др.), а также, что особенно важно, различные сахаросодержащие отходы - продукты переработки и гидролиза растительного сырья, отходы пищевой, фармацевтической, спиртовой, целлюлозно-бумажной промышленности. Возможность привлечения отходов для производства ПГА является вкладом в современную концепцию замкнутой экономики и важно по ряду значимых позиций:

- первое, привлечение отходов снижает затраты на ростовой субстрат и стоимость целевых продуктов биотехнологии, повышая их доступность и расширяя области применения;

- второе, вовлечение отходов в биотехнологические процессы способствует экологизации, снижая объемы накопления отходов в биосфере и затраты на утилизацию;

- третье, использование отходов для получения востребованных продуктов биотехнологии с высокой добавленной стоимостью повышает эффективность использования сырьевых ресурсов в производственных процессах и их эффективность в целом.

В настоящее время сформировалась проблема необходимости переработки и утилизации жиросодержащих отходов пищевой промышленности и перерабатывающих отраслей в связи с отсутствием рациональных технологий переработки используемого сырья растительного и животного происхождения. Количество генерируемого отработанного жира ежегодно на земном шаре составляет порядка 29 миллионов тонн в год, среди них - жирные кислоты, низкосортные масла растительного и животного происхождении, отработанные кулинарные жиры и др. отходы, а с недавнего времени - жировые отходы рыбопереработки. Отработанные кулинарные жиры в настоящее время нашли применение в производстве биодизеля. Применение подобных крупнотоннажных возобновляемых жировых отходов рассматривают сегодня в качестве потенциального и доступного субстрата для синтеза разрушаемых ПГА.

Наряду с пищевой промышленностью, перерабатывающей сырье и продукты сельского хозяйства, значительный вклад в накопление жировых отходов вносит рыбоперерабатывающая отрасль, объемы производства которой растут, превысив в 2020 году 70 млн. тонн. C ростом мирового производства рыбы в процессах рыболовства и рыбоводства увеличивается количество образующихся отходов, которые составляют от 20 до 80% исходной рыбы и включают поврежденную целую рыбу, несъедобные части (головы, хребты, внутренности, кожу и др.). Содержание жира в рыбных отходах может достигать 60%, при этом не более 20-23% используют в качестве сырья для получения рыбной муки и жиров технического назначения; остальное, как правило, выбрасывается или требует утилизации с неизбежными затратами. В мировом масштабе выбросы рыбоперерабатывающей отрасли превышают 20 миллионов т/год, что составляет 25% от общего объема вылова морского рыбного промысла. Это означает наличие и ежегодную доступность большого количества возобновляемого жиросодержащего сырья, которое может быть использовано для получения продуктов с добавленной стоимостью (рыбий жир, омега-3 жирные кислоты, белковые продукты, ПГА и др. [1].

При применении жиров в качестве субстратов в биотехнологических процессах необходимо обеспечения условий гидролиза и эмульгирования жира в культивационной среде для его доступности микробным клеткам, которые определяются активностью липолитических ферментов микроорганизмов. При контакте микробных клеток с каплями жира клетки экскретируют липазы, под воздействием которых сложные компоненты жировых субстратов гидролизуются с образованием свободных жирных кислот и глицерина на границе раздела фаз липидов и воды. Продукты гидролиза жира формируют в культуральной среде эмульсию, и исходно сложный липидный субстрат становится доступным для клеток, поступает в них и метаболизируется. От липазной активности штаммов-продуцентов зависит эффективность усвоения жирового субстрата и трансформации в целевые продукты, а от полноты утилизации субстрата зависит экономика биотехнологических процессов в целом.

Жиросодержащие отходы рыбоперерабатывающей отрасли - это потенциально новый, но пока мало изученный источник углеродного сырья, который может стать крупнотоннажным и возобновляемым субстратом для получения целевых продуктов биотехнологии, включая производство разрушаемых микробных полигидроксиалканоатов (ПГА). Исследование жировых отходов рыбопереработки для синтеза ПГА начато недавно, и количество информации в настоящее время ограничено.

Известны природные штаммы Pseudomonas, которые при росте на гидролизованном жире отходов минтая в зависимости от физиологических особенностей способны синтезировать от 42 до 69% ПГА при урожае биомассы от 1.7 до 4.8 г/л [2].

Известен природный штамм Bacillus subtilis (KP172548), который способен синтезировавать от 1.62 до 2.3 г/л биомассы клеток с содержанием гомополимера П3ГБ до 48-53% [3].

Известен природный штамм умеренно галофильной бактерии Salinivibrio sp. М318, выделенный из ферментированной креветочной пасты, который способен использовать сложный субстрат - смесь отработанного рыбьего жира из отходов рыбы пангасиус (Pangasius bocourti) и глицерина с выходами по урожаю биомассы в колбах до 10.0 г/л при содержание полимера 51,7% [4].

Известны природные штаммы, отнесенных к роду Ralstonia (род позднее переименован в Cupriavidus), синтезирующих ПГА на сыром жире из отходов минтая. Восемь штаммов синтезировали поли-3-гидроксибутират от 7,4 до 50,1 мас.%. Наиболее результативный штамм M91 на среде с 15 г/л жира в колбах синтезировал до 3,93 г/л биомассы клеток при внутриклетчоной концентрации полимера в них 2,43 г/л; в 10-л ферметере урожай биомассы был выше (5,32 г/л) при аналогичном уровне полимера (2,73 г/л) [5].

Известен природный штамм C. necator TISTR 1095, который синтезировал до 7,5 г/л биомассы клеток с содержанием сополимерных ПГА до 50% с использованием конденсата жировых отходов переработки тунца [6].

Известен природный штамм Bacillus subtilis KP172548, который на среде с экстрактом жирных кислот из отходов рыбопереработки обеспечивал получения урожая биомассы клеток 1,62-2,3 г/л; содержание полимеров в клетках 22-37% [7].

Недостатки этих штаммов как продуцентов ПГА и аналогов изобретения - низкие показатели по синтезу ПГА и урожаю биомассы бактерий, а также отсутствии данных о липазной активности штаммов и полноте использования жирового субстрата в процессах синтеза ПГА.

Техническим решением, принятым в качестве наиболее близкого аналога заявляемого изобретения, является известный природный штамм C. necator В-10646 [8], способный синтезировать при росте на жировых отходах рыбопереработки разрушаемые ПГА и белок одноклеточных [9, 10].

Штамм C. necator B-10646 имеет низкую липазную активность (на уровне 6-8 U/мл). Штамм выращивают на жировом субстрате, полученном из отходов при производстве шпрот, в периодическом режиме синтеза ПГА в колбочной культуре на солевой среде Шлегеля с дефицитом азота. При варьировании концентрации жирового субстрата от 15,0 до 25, 0 г/л за 72 ч процесса штамм синтезировал в клетках от 58 до 62% ПГА при урожае биомассы бактерии от 4.3 до 4.7 г/л. Использованный жировой субстрат содержал 20 жирных кислот с длиной С-цепи от С14 до С24; которые штамм метаболизировал неравномерно. Поэтому на фоне утилизации полиеновых и ненасыщенных ЖК, в культуре накапливались плохо утилизируемые штаммом моноеновые и насыщенные ЖК. Полнота использования жирового субстрата не превышала 45-50%. В периодическом режиме c подпиткой культуры жировым субстратом при снижение его исходной концентрации до 10 г/л, полнота утилизации субстрата составила 60%; урожай биомассы 6.5+0.5 г/л, концентрация ПГА 60+5%.

Недостатки штамма как прототипа изобретения следующие:

- низкие показатели по синтезу ПГА;

- низкие показатели по урожаю биомассы бактерий;

- низкая липазная активность штамма;

- неравномерное потребление штаммом жирных кислот жирового субстрата и накопление в культуре плохо утилизируемых ненасыщенных ЖК;

- крайне низкий показатель штамма по полноте использования жирового субстрата при синтезе ПГА.

Задачей заявляемого изобретения является изыскание нового продуктивного штамма, обладающего высокой липазной активностью и способного к устойчивому росту с высокими показателями по синтезу ПГА (не ниже 70%) и урожаю биомассы клеток (не ниже 10 г/л в колбочной культуре) на жировых отходах рыбопереработки в качестве основного ростового субстрата с высокой полнотой его использования не менее 92 % и синтезу с высокими выходами ПГА различного состава, включая сополимеры с пониженной степень кристалличности (ниже 50%), содержащие в качестве макровключений (не ниже 10-20 мол.%) помимо мономеров 3-гидроксибутирата, мономеры 3-гидроксивалерата и 4- гидроксибутирата.

Технический результат достигается тем, что выявлен штамм C. necator B-15081, депонированный в Национальном Биоресурсном Центре Всероссийская коллекция Промышленных Микроорганизмов (БРЦ ВКПМ) НИЦ «Курчатовский институт» - ГосНИИГенетика под регистрационным номером ВКПМ B-15081, в качестве продуцента для получения разрушаемых микробных пластиков ПГА на жировых отходах рыбопереработки.

Сущность изобретения поясняется чертежами. На фиг. 1 дана блок схема синтеза ПГА на жировых отходах рыбопереработки. На фиг. 2 даны ионная хроматограмма и масс-спектр образца ПГА, синтезированного C. necator B-15081 на жировых отходах рыбопереработки в качестве источника углерода (время удержания мономеров 3-гидроксибутирата - 5,745 мин, 3-гидроксивалерата - 7,273 мин, 3-гидроксигексаноата - 8,898 мин). На масс-спектрах цифрами обозначены пики, по которым происходит идентификация вещества. На фиг. 3 изображены ¹Н ЯМР спектры сополимерных образцов ПГА (П(3ГБ-со-4ГБ)), цифрами обозначены пики колебаний соответствующих атомов.

Штамм выделен из почвы (чернозем выщелоченный, мало- и среднемощный, тяжелосуглинистого гранулометрического состава) в окрестностях г. Красноярска (Сухобузимский район, с. Миндерла) (Сибирский регион РФ) и исследован в лаборатории хемоавтотрофного биосинтеза Института биофизики СО РАН.

Штамм выделен методом накопительных культур с последующей ступенчатой автоселекцией при пересевах на известной минеральной среде Шлегеля с использованием для роста в качестве источника углерода в том числе субстраты жировой природы (жирные кислоты, растительные масла) при температуре 30°С и рН среды 7,0.

Идентификация штамма выполнена по физиологическим, биохимическим, культуральным и генетическим признакам. Систематическое положение штамма подтверждено результатами времяпролетной лазерной десорбцией/ионизацией с использованием матрицы (MALDI-TOF) (метод масс-спектрометрии) с использованием масс-спектрометра MALDI-TOF MS Microflex (Bruker Daltonics, Бремен, Германия) на основе автоматического анализа масс-спектров белковых молекул, специфичных для данного вида микроорганизмов. Клонирован и охарактеризован ДНК фрагмент 1454 н.п., включающий нуклеотидную последовательность гена, кодирующего 16S рРНК; депонирован в базе данных GenBank NCBI под номером PP524754.1.

Штамм бактерий грамотрицателен. В фазе активного роста размер бактериальных клеток составляет 0,3-0,5 мкм; в стационарной фазе - 1,2-2,0 мкм; клетки подвижные (молодые клетки - монотрихи, с возрастом - перетрихи). Оптимум роста 30,0±2,0°C; рН 7,0±0,1 на солевой среде Шлегеля [2], Na₂HPO₄×12H₂O - 9.1, KH₂PO₄ - 1.5, MgSO₄×7H₂O - 0,2; Fe₃C₆H₅O₇×nH₂O - 0,025, NH₄Cl - 1,0 (г/л); 3 мл/л раствора микроэлементов (H₃BO₃ - 0,228, CoCl₂×6H₂O - 0,030, CuSO₄×5H₂O - 0,008, MnCl₂×4H₂O - 0,008, ZnSO₄×7H₂O - 0,176, NaMoO₄×2H₂O - 0,05, NiCl₂ - 0,008 (г/л).

Морфология колоний: на пептонном агаре: штамм образуют светло-кремовые, блестящие, не прозрачные колонии, со слегка приподнятыми, слабоволнистыми краями. С возрастом колонии пигментируются до светло-коричневого цвета. Диаметр колоний в зависимости от возраста может варьировать от 0,2 до 1,5 см.

Штамм - облигатный аэроб; факультативный хемолитоавтотроф. Оксидазоположителен. Гидролитическими ферментами не обладает. Желатину не разжижает. Крахмал не гидролизует. При хемолитоавтотрофии растет на солевой среде в атмосфере СО₂ (источник углерода), водорода (источник энергии) и кислорода с соотношением газов в смеси как СО₂:О₂:Н₂=10:20:70 объемных %. Обладает широким органотрофным потенциалом и способен в качестве источника углерода, помимо СО₂, использовать: сахара (глюкоза, фруктоза), аминокислоты (аланин, серин, лейцин, гистидин, триптофан, глутаминовую кислоту, аспарагиновую кислоту, лизин), спирты (этанол, глицерин), кислоты (щавелевую, лимонную, янтарную, уксусную, масляную, пентановую, гексановую, 3-меркаптопропионовую, олеиновую, пальмитиновую, лауриновую, миристиновую, стеариновую), растительные масла (пальмовое, рапсовое, подсолнечное, рыжиковое); 1,6-гександиол, 1,4-бутандиол, ε-капролактон, γ-валеролактон. Липазная активность штамма при росте на растительных маслах составляет не менее 15-20 единиц активности на один миллилитр. В качестве источника азота использует нитраты, соли аммония, мочевину, аминокислоты.

В жидкой питательной среде рост штамма диффузный с образованием однородной суспензии. На полной питательной среде штамм характеризуется белковой направленностью биосинтеза. В специализированном периодическом режиме выращивания и дефиците в среде минеральных макроэлементов (азот и/или сера и др.) синтез белка падает на фоне суперпродукции резервных полимеров гидроксиалкановых кислот - ПГА.

На солевой питательной среде при лимитировании роста дефицитом минеральными элементами (азота, серой) и гетеротрофном росте в колбах в периодической культуре на сахарах, глицерине, ЖК и липидных субстратах концентрация биомассы и содержание полимера составляют, соответственно, до 9-10 г/л и 80-85% от веса сухой биомассы. При введении в состав среды дополнительно к основному углеродному субстрату С-субстратов-прекурсоров штамм способен к синтезу сополимерных ПГА, содержащих, помимо мономеров 3-гидроксибутира, мономеры 4-гидроксибутирата, 3- и 4-гидроксивалерата, 3-гидроксигексаноата, серосодержащие мономеры (3-меркаптопропионат). На полной питательной среде штамм синтезирует полный набор аминокислот, включая незаменимые, и белка до 67-71% от веса сухой биомассы.

Способ, условия и состав сред для длительного хранения штамма. Хранение музейной культуры штамма осуществляется на плотных питательных средах: для роста в автотрофных условиях - на скошенном минеральном агаре (20 г агара на 1 л полной среды Шлегеля (пропись представлена выше); для гетеротрофных процессов - на скошенном пептонном агаре (в 1 л водопроводной воды 20 г агара, 10 г пептона, 10 мл 2.5%-ного раствора NaCl); частота пересевов - 30-40 суток; хранение музейной культуры - при температуре 4-5°C (в бытовом холодильнике). Длительное хранение штамма возможно в лиофилизированном виде с использованием в качестве криопротектора сахаров.

Оптимальные условия и состав среды для выращивания штамма: оптимум по температуре среды составляет 30,0±2,0°C при активной реакции среды рН 7,0±0,1 и использовании солевой среды Шлегеля следующего состава: Na₂HPO₄×12H₂O - 9.1, KH₂PO₄ - 1.5, MgSO₄×7H₂O - 0,2; Fe₃C₆H₅O₇×nH₂O - 0,025, NH₄Cl - 1,0 (г/л); 3 мл/л раствора микроэлементов (H₃BO₃ - 0,228, CoCl₂×6H₂O - 0,030, CuSO₄×5H₂O - 0,008, MnCl₂×4H₂O - 0,008, ZnSO₄×7H₂O - 0,176, NaMoO₄×2H₂O - 0,05, NiCl₂ - 0,008 (г/л). Для режима ферментации с целью синтеза полимеров реализуют строго стерильный периодический процесс длительностью 60-80 ч при стартовой концентрации источника углерода 10-20 г/л.

Продукт, синтезируемый штаммом, - разрушаемые полигидроксиалканоаты («зеленые» биопластики), аминокислоты, белок одноклеточных. Область применения штамма: техническая микробиология; биотехнология - в качестве продуцента целевых продуктов; в образовательном процессе как модельный объект изучения хемолитоавтотрофии, миксотрофии, гетеротрофии при подготовке в университетах бакалавров и магистров по специальностям Микробиология, Биотехнология

Преимущества выявленного нового штамма - продуцента ПГА:

- устойчивый продуктивный рост штамма на средах, содержащих в качестве основного ростового субстрата жиросодержащие отходы рыбопереработки;

- высокая липазная активность штамма, обеспечивающая гидролиз и доступность для усвоения клетками жиросодержащих субстратов из отходов рыбопереработки для синтеза ПГА;

- высокая степень усвоения штаммом жировых субстратов рыбопереработки;

- высокие выходы ПГА на жировых субстратах рыбопереработки;

- высокие показатели штамма по урожаю биомассы клеток на жировых субстратах;

- способность штамма к синтезу сополимерных ПГА, содержащих помимо 3-гидрокисбутирата, макровключения мономеров 3-гидроксивалерата и 4-гидроксибутирата;

- способность штамма к синтезу ПГА, имеющих степень кристалличности ниже 50%.

Признаки, отличающие заявляемое техническое решения от прототипа, не выявлены в других технических решениях при изучении данных в смежных областях техники и, следовательно, обеспечивают заявляемому решению соответствие критериям «новизна» и «изобретательский уровень».

Для реализации режима синтеза ПГА штамм C. necator B-15081 выращивают в периодическом режиме на известной солевой среде Шлегеля с уменьшенной до 0,6-0,7 г/л источника азота NH₄Cl (фактор максимизации накопление в клетках резервных полимеров - ПГА). В составе среды в качестве углеродного ростового субстрата используют жировые отходы рыбопереработки: головы копченой балтийской кильки (Sprattus sprattus balticus) - отход шпротного производства, и головы свежей скумбрии (Scomber scombrus), отходы, образуемые при разделке тушек для последующего копчения, посола, заморозки и пр. Выбор отходов обусловлен их большими объемами и доступностью. Мировой улов кильки, используемый для производства консервированных шпрот, составляет до 500 тыс. тонн в год. Шпротные консервы производят во многих странах и России, но в образуемых при их производстве отходах присутствуют коптильные элементы, включая токсичные бензопирены. Это ограничивает использование отходов в составе комбикормов, поэтому их вывозят на полигоны твердых отходов для сжигания. Скумбрия входит в число основных промысловых видов рыб; ее годовой вылов достигает 2,0-2,5 миллионов тонн, из которых до 30-35% составляют отходы, в которых самая крупная фракция (порядка 23%) приходится на головы.

Жир извлекают из рыбных отходов после измельчения; смешивают с водой в соотношении 1:1 и нагревают и выдерживают при 90°С при перемешивании 15-20 мин. Охлажденную смесь центрифугируют при 5000 оборотов в минуту; жировую фракцию супернатанта отделяется от нежировой фракции декантацией. Далее, полученную жировую фракцию анализируют, определяют содержание общих липидов и состав жирных кислот, углеводов, общего азота и сырого протеина (общий азот х коэффициент 6.25) общепринятыми аналитическими методами. Охарактеризованные партии жира используют в качестве ростового субстрата в биотехнологических процессах для синтеза ПГА в культуре нового штамма C. necator B-15081.

Музейную культуру штамма C. necator B-15081, хранящуюся при 5°С на агаризованной среде, ресуспензируют в стерильных условиях в приготовленной питательной среде и выращивают при постоянной аэрации и перемешивании в термостатируемом шйкере-инкубаторе «Incubator Shaker Innova» (New Brunswick Scientific, Edison, NJ, США) в стеклянных колбах объемом 1,0 л с коэффициентом заполнения 0,5 (скорость 250 оборотов в минуту) при 30°С и рН 7,0±0,1 в периодическом режиме. Длительно процесса составляет от 50 до 60 ч. Для получения сополимерных ПГА в культуру бактерий дробно, в виде небольших добавок (1,0-1,5 г/л), вносят субстраты - прекурсоры целевых мономеров: валерат калия - предшественник для синтеза мономеров 3-гидрокисбутирата) и капролактон - предшественник для синтеза мономеров 4-гидрокисбутирата.

В процессе культивирования штамма-продуцента определяют урожай биомассы клеток (Х, г/л) взвешиванием образов промытой, отцентрифугированной и высушенной до постоянного веса биомассы клеток. Для детектирования внутриклеточной концентрации ПГА, состава и соотношения мономеров в ПГА используют методы газовой хроматографии, совмещенной с масс-спектрометрией, после предварительного метанолиза проб. Детектируют метиловые эфиры жирных кислот, входящих в состав ПГА. Процедуру проводят на хромато-масс-спектрометре Agilent Technologies 7890А с масс детектором 5975С («Agilent Technologies», США).

Выделение полимера из биомассы проводят дихлорметаном, полученный экстракт после его концентрирования на роторном испарителе Rotavapor R-210 (Швейцария) осаждают изопропанолом. Для получения высокоочищенных образцов процедуру перерастворения и осаждения образцов ПГА повторяют несколько раз. Для анализа состава ПГА и корректного определения соотношения мономеров, помимо газовой хроматографии, совмещенной с масс-спектрометрией, применяют ЯМР спектроскопии и снятием ¹Н ЯМР спектров (Bruker Avance III 600, Германия). По результатам исходного содержания жира в среде и состава ЖК жирового субстрата в исходной среде и в остаточном (неутилизивроанном бактериями субстрате) определяют полноту использования жирового субстрата и входящих в него жирных кислот.

Очищенные до гомогенного состояния образцы ПГА используют для детектирования базовых физико-химических свойств. С использованием системы гельпроникающей хроматографии (Agilent Technologies 1260 Infinity, Waldbronn, Геомания) определяют средневесовую и среднечисловую молекулярную массу и полидисперсность образцов ПГА относительно полистероловых стандартов фирмы «Sigma-Aldrich». Рентгеноструктурный анализ проводят для определения степени кристалличности образцов (Сх) с использованием рентгеноспектрометра D8 ADVANCE фирмы «Bruker» (Германия). Для анализа термических свойств ПГА проводят комплексный термический анализ с использованием дифференциального сканирующего калориметра DSC-1 (Mettler Toledo, Schwerzenbac, Switzerland) с определением температура плавления по экзотермическим пикам на термограммах. С помощью системы термического анализа TGA2 (Mettler Toledo, Schwerzenbac, Switzerland) определяют термическую деградацию образцов.

Получение разрушаемых ПГА штаммом C. necator B-15081 с использованием жировых отходов рыбопереработки в качестве ростового субстрата иллюстрируют следующие примеры.

Пример 1

Музейную культуру штамма-продуцента C. necator B-15081 суспендируют в жидкой солевой среде, которая содержит качестве основного ростового субстрата 20,0 г/л жира, полученного из голов копченой кильки, в котором соотношение насыщенных и ненасыщенных жирных кислот составляет 0,21-0,26: В составе среды минеральные макроэлементы (г/л): Na₂HPO₄⋅H₂O - 9.1, KH₂PO₄ - 1.5; MgSO₄⋅H₂O - 0.2, Fe₃C₆H₅O₇·7H₂O - 0.25, NH₄Cl - 0,7 и 3 мл/л среды стандартного раствора микроэлементов по Хоагланду, который содержит микроэлементы: H₃BO₃ - 0.228, CoCl₂×6H₂O - 0.030, CuSO₄×5H₂O - 0.008, MnCl₂×4H₂O - 0.008, ZnSO₄×7H₂O - 0.176, NaMoO₄×2H₂O - 0.050, NiCl₂ - 0.008 (г/л). Культивирование штамма-продуцента проводят в периодическом режиме в стеклянных колбах объемом 1,0 л при коэффициенте заполнения 0.5 в термостатируемом шейкере-инкубаторе при 30°C и pH 7.0 в течение 60 ч. Урожай биомассы клеток выращиваемого штамма составляет 12,0 г/л, внутриклеточное содержание ПГА 76,4%. Штамм утилизирует жирные кислоты равномерно; включая насыщенные ЖК; полнота использования жирового субстрата составляет 80 %. Синтезированный ПГА - сополимер, который содержит от 96,69 мольных % мономеров 3-гидроксибутирата и минорные включения мономеров 3-гидроксивалерата. 2,67мольных % и 3-гидрокисгексаноата 0,64 мольных %. Показатели биотехнологического процесса иллюстрируют таблицы №№1, 2, 3; свойства синтезированного сополимера - таблица №5.

Пример 2

Культивирование штамма C. necator B-15081 проводят аналогично Примеру 1. Для синтеза сополимерных ПГА с макровключениями мономеров 3-гидроксивалерата в культуру на 10-12-м часе процесса вносят 3 добавки валерата калия по 1,5 г/л с интервалом по 8 ч. Урожай биомассы клеток за 50 ч процесса составляет 11,8 г/л, внутриклеточное содержание ПГА 80,1%; полнота использования жирового субстрата 82%. Синтезированный сополимер 67,18 мольных % 3-гидроксибутирата, 32,31 мольных % мономеров 3-гидроксивалерата; следы 3-гидрокисгексаноата. Показатели процесса иллюстрируют таблицы №№1,2,3; свойства синтезивроанного сополимера - таблица №5.

Пример 3

Культивирование штамма C. necator B-15081 проводят аналогично Примеру 2. Для синтеза сополимерных ПГА с макровключениями мономеров 4-гидроксибутирата в культуру на 12-м ч процесса вносят 3 добавки ε-капролактона по 2 г/л с интервалом по 10 ч. Урожай биомассы клеток за 50 ч процесса составляет 10,6 г/л, внутриклеточное содержание ПГА 75,4%; полнота использования жирового субстрата 81%. Синтезированный сополимер содержит 80,57 мольных % мономеров 3-гидрокибутирата, 18,31 мольных % мономеров 4-гидроксибутирата; 1,12 мольных % 3-гидроксивалерата. Показатели процесса иллюстрируют таблицы №№1, 2, 3; свойства синтезированного сополимера - таблица №5.

Пример 4

Культивирование штамма C. necator B-15081 проводят аналогично Примеру 1, но в качестве основного ростового субстрата среда содержит 20,0 г/л жира, полученного из голов свежей скумбрии, в котором соотношение насыщенных и ненасыщенных жирных кислот составляет 0,24. Длительность процесса культивирования штамма 60 ч. Урожай биомассы клеток составляет 11,3 г/л, внутриклеточное содержание ПГА 83,0 %; полнота использования жирового субстрата 80 %. Синтезированный сополимер содержит мономеры 3-гидроксибутирата и минорные включения мономеров 3-гидроксивалерата и 3-гидрокисгексаноата. Показатели процесса иллюстрируют таблицы №№1, 2, 3; свойства синтезированного сополимера - таблица №5.

Пример 5

Культивирование штамма C. necator B-15081 проводят аналогично Примеру 4. Для синтеза сополимерных ПГА с макровключениями мономеров 3-гидроксивалерата в культуру на 10-м ч процесса вносят 3 добавки валерата калия по 1,5 г/л с интервалом 10 ч. Урожай биомассы клеток за 50 ч процесса составляет 10,9 г/л, внутриклеточное содержание ПГА 76,3%; полнота использования жирового субстрата 80,6%. Синтезированный сополимер содержит 50,31 мольных % 3-гидроксибутирата, 48,56 мольных % мономеров 3-гидроксивалерата; следы 3-гидрокисгексаноата. Показатели процесса иллюстрируют таблицы №№1, 2, 3; свойства синтезированного сополимера - таблица №5.

Пример 6

Культивирование штамма C. necator B-15081 проводят аналогично Примеру 4. Для синтеза сополимерных ПГА с макровключениями мономеров 4-гидроксибутирата в культуру на 10-м ч процесса вносят 2-3 добавки ε-капролактона по 2 г/л с интервалом по 10 ч. Урожай биомассы клеток за 50 ч процесса составляет 10,6 г/л, внутриклеточное содержание ПГА 75,1%; полнота использования жирового субстрата 82%. Синтезированный сополимер содержит 74,58 мольных % мономеров 3-гидроксибутирата, 23,91 мольных % мономеров 4-гидроксибутирата; 1,52 мольных % 3-гидроксивалерата. Показатели процесса иллюстрируют таблицы №№1, 2, 3; свойства синтезированного сополимера - таблица №5.

Таблица 1 - Показатели биотехнологического синтеза ПГА штаммом - продуцентом C. necator B-15081 на жировых субстратах из отходов рыбопереработки

Примеры реализации изобретения	Х, г/л	ПГА, г/л	ПГА, %	Состав мономеров ПГА, мол.%					ε-полнота использования субстрата, %
				3ГБ	4ГБ	3ГВ		3ГГ
Жир из голов копченой кильки (Sprattus balticus)
Пример 1	12,0	10,37	86,4	96,69	0	2,67		0,64	80,0
Пример 2	11,8	9,45	80,1	67,18	0	32,31		0,51	82,0
Пример 3	10,6	7,99	75,4	80,57	18,31	1,12		0	81,2
Жир из голов свежей скумбрии (Scomber scombrus)
Пример 4	11,3	9,38	83,0	97,03	0	2,45	0,52		80,0
Пример 5	10,9	8,32	76,3	50,31	0	48,56	1,13		80,6
Пример 6	10.6	7,96	75,1	74,58	23,91	1,52	0		82,0

Примечание:

Х - урожай биомассы бактерий (г/л), ПГА (г/л) - урожай полимеров в культуре, ПГА(%) - внутриклеточная концентрация полимеров (в % к абсолютно сухой биомассе), ε-полнота использования субстрата ( %), вычисляемая по разнице поданного в культуру жира и остаточного не утилизированного в конце процесса выращивания штамма-продуцента.

Таблица 2 - Биохимический состав компонентов жира, полученного из отходов рыбопереработки (% массы жира)

Отходы - источник получения жира	Липиды	«Сырой» протеин	Углеводы
Головы копченой кильки	99.3±3.3	0.03±0.01	1.78±0.21
Головы свежей скумбрии	96.3±2.5	0.03±0.01	1.53±0.14

Таблица 3 - Состав жирных кислот (ЖК) жирового субстрата в исходной питательной среде для выращивания бактериями C. necator B-15081 и синтеза ПГА

Состав жирных кислот (% от суммы ЖК)	Жир из голов копченой кильки	Жир из голов свежей скумбрии
14:0	3.46±0.21	4.54±0.16
15:0	0.55±	0.61±0.02
16:1ω7	4.46±0.57	4.91±0.28
16:0	19.87±0.49	16.95±0.71
16:4	-	0.35±0.2
16:3	-	0.29±0.01
18:0	5.98±0.25	5.84±0.12
18:1ω9	20.15±1.17	14.98±0.39
18:1	2.97±0.13	3.42±0.21
18:3ω3	3.76±0.28	0.97±0.02
18:4	2.53±0.57	0.56±0.08
20:0	0.33±0.02	0.66±0.04
20:1ω9	0.42±0.28	4.33±0.11
20:2	0.43±0.03	0.23±0.01
20:5ω3	11.10±0.37	12.77±0.38
20:4	1.20±0.29	0.88±0.03
20:3	0.22±0.02	0.25±0.02
22:0	0.24±0.02	0.40±0.02
22:1	0.15±0.01	4.83±0.27
22:2	0.04±0.01	-
22:5	0.30±0.02	0.61±0.02
22:6ω3	17.32±2.79	20.47±0.93
24:1ω9	0.94±0.06	0.61±0.11
Other*	3.64	1.15±0.06
Σsaturated FAs	32.51±1.04	29.58±1.27
Σunsaturated FAs	67.49±2.11	70.42±3.53
Σsaturated FAs/ Σunsaturated FAs	0.48±0.02	0.42±0.1
Σmonounsaturated FAs	30.65±0.97	33.04±2.04
Σpolyunsaturated FAs	36.84±0.52	37.38±1.83
Σlong-chain FAs	32.69±1.31	46.04±2.33

Таблица 4 - Состав жирных кислот (ЖК) остаточного жирового субстрата, не утилизированного бактериями C. necator B-15081 в процессе синтеза ПГА

Состав жирных кислот (% от суммы ЖК)	Жир из голов копченой кильки	Жир из голов свежей скумбрии
14:0	1.59±0.04	1.43±0.05
i-14:0	0.25±0.02	0.26±0.01
15:0	0.31±0.02	0.56±0.02
i-15:0	0.19±0.01	0.17±0.01
16:1ω7	3.39±0.31	4.94±0.23
16:0	11.15±0.25	10.81±0.56
16:1	0.27±0.01	0.12±0.00
i-16:0	-	-
17:0	-	0.21±0.01
17:1	0.61±0.02	0.15±0.00
18:0	6.97±0.23	8.14±0.34
18:1ω9	70.13±4.42	67.81±4.11
18:1	4.31±0.39	4.05±0.23
20:1ω9	0.83±0.10	0.60±0.13
22:1ω9	-	0.10±0.00
24:1ω9	-	0.65±0.04
Σsaturated FAs	20.46±1.05	21.58±1.14
Σunsaturated FAs	79.54±4.21	78.42±3.98
Σsaturated FAs/ Σunsaturated FAs	0.26±0.01	0.28±0.01
Σmonounsaturated FAs	79.54±4.21	78.42±3.98
Σpolyunsaturated FAs	0.00±0.00	0.00±0.00
Σlong-chain FAs	0.83±0.10	1.35±0.05

«-» - означает отсутствие.

Таблица 5 - Химический состав и свойства образцов ПГА, синтезированных C. necator B-15081 на жировых субстратах из отходов рыбопереработки

Примеры реализации изобретения	Состав мономеров в ПГА, мол.%				Mч, кДа	Mв, кДа	Đ	Cx, %	Tпл, °C	Tдегр, °C
	3ГБ	4ГБ	3ГВ	3ГГ
Жир из голов копченой кильки (Sprattus balticus)
Пример 1	96,69	0	2,67	0,64	125	477	3.82	46	167,0	283,5
Пример 2	67,18	0	32,31	0,51	123	421	3,4	39	160,4	271,2
Пример 3	80,57	18,31	1,12	0	96	382	4,0	32	165,2	274,5
Жир из голов свежей скумбрии (Scomber scombrus)
Пример 4	97,03	0	2,45	0,52	121	471	3,89	48	169,4	278,2
Пример 5	50,31	0	48,56	1,13	141	438	3,1	41	167,2	277,3
Пример 6	74,58	23,91	1,52	0	104	429	4,1	40	166,8	278,6

Примечание:

М_ч - среднечисловая молекулярная масса; M_в - средневесовая молекулярная масса; Đ- полидисперсность; С_х, % - степень кристалличности; T_пл, °C - температура плавления; Т_дегр, °C - температура термической деградации.

Применение штамма C. necator B-15081, имеющего высокую липазную активностью (не ниже 15-20 единиц активности на миллилитр), позволяет получать ПГА различного химического состава с высокими выходами c использованием жировых отходов рыбопереработки в качестве основного ростового субстрата при высокой степени его усвоения (таблицы 1 и 5).

Список литературы

1. F.B. Rebah, N. Miled, Fish processing wastes for microbial enzyme production: a review, 3 Biotech 3 (2013) 255-265, https://doi.org/10.1007/s13205-012-0099-8; G. Caruso, Fishery waste and by-products: a resource to be valorized, J. Fishscicom. 10 (2016) 12-15.

2. R.D Ashby, D. K. Y. Solaiman. Poly(hydroxyalkanoate) Biosynthesis from Crude Alaskan Pollock (Theragra chalcogramma) Oil .J Polym Environ (2008) 16:221-229.DOI 10.1007/s10924-008-0108-5.

3. S. Mohapatra, B. Sarkar, D. P. Samantaray, A. Daware, S. Maity, S. Pattnaik &S. Bhattacharjee Bioconversion of fish solid waste into PHB using Bacillus subtilis based submerged fermentation process // Environmental Technology- 2017- Vol. 38, NO. 24, 3201-3208.

4. D.V. Thuoc, D.N. My, T.T.Loan, Kumar Sudesh. Utilization of waste fish oil and glycerol as carbon sources for polyhydroxyalkanoate production by Salinivibrio sp. M318 Int Biol Macromol.2019.141:885-892. https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2019.09.063

5. D.V. Thuoc and V.T.M. Anh. Bioconversion of Crude Fish Oil Into Poly-3-hydroxybutyrate by Ralstonia sp. M91 // Applied Biochemistry and Microbiology, 2021, Vol. 57, No. 2, pp. 219-225.

6. Sangkharak, K.; Paichid, N.; Yunu, T.; Klomklao, S.; Prasertsan, P. Utilisation of tuna condensate waste from the canning industry as a novel substrate for polyhydroxyalkanoate production. Biomass Convers. Biorefinery 2021, 11, 2053-2064.doi.10.1007/s13399-19-00581-4.

7. Argiz, L.; Gonzalez-Cabaleiro, R.; Correa-Galeote, D.; del Rio, A.V.; Mosquera-Corral, A. Open-culture biotechnological process for triacylglycerides and polyhydroxyalkanoates recovery from industrial waste fish oil under saline conditions. Sep. Purif. Technol. 2021, 270, 118805.

8. Патент RU № 2439143, опубл. 10.01.2012.

9. Жила Н.О., Волков В.В., Мезенова О.Я, Киселев Е.Г., Волова Т.Г. Отходы рыбопереработки - перспективный субстрат для синтеза целевых продуктов биотехнологии// Журнал СФУ - Биология. - 2023 - Т. 16(3) - с.386-397.

10. N.O. Zhila, K.Yu. Sapozhnikova, E.G. Kiselev, E.I. Shishatskaya, T.G. Volova. Synthesis and properties of polyhydroxyalkanoates on waste fish oil from the production of canned sprats// Processes - 2023 - Vol.11(7) - 2113. https://doi.org/10.3390/pr11072113

Формула изобретения

Штамм Cupriavidus necator, депонированный в Национальном Биоресурсном Центре Всероссийская коллекция Промышленных Микроорганизмов (БРЦ ВКПМ) НИЦ «Курчатовский институт» - ГосНИИГенетика под регистрационным номером В-15081 в качестве продуцента для получения разрушаемых микробных пластиков полигидроксиалканоатов на жировых отходах рыбопереработки.