РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА ПО ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ, ПАТЕНТАМ И ТОВАРНЫМ ЗНАКАМ	(19) RU (11) 2 242 238 (13) C1
	(51) МПК A61K 35/56 (2000.01) A61P 31/14 (2000.01)

Статус:	не действует (последнее изменение статуса: 03.07.2023)
Пошлина:	учтена за 20 год с 03.07.2022 по 02.07.2023. Патент перешел в общественное достояние.

(21)(22) Заявка: 2003120271/15, 02.07.2003 (24) Дата начала отсчета срока действия патента: 02.07.2003 (45) Опубликовано: 20.12.2004 Бюл. № 35 (56) Список документов, цитированных в отчете о поиске: КРЫЛОВА Н.В. и др. Сравнительное изучение in vitro эффективности различных иммуномодулирующих препаратов при клещевом энцефалите. Вопросы вирусологии. 2001, т.46, №1, январь-февраль, с.25-28. RU 2110522 C1, 10.05.1998. CN 1136436, 27.11.1996. Реферат из АБД Medline: Maier MS et al. Two new cytotoxic and virucidal trisulfated triterpene glycosides from the Antarctic sea cucumber Staurocucumis liouvillei. J. Nat. Prod. 2001, Jun; 64(6):732-6. Адрес для переписки: 690022, г.Владивосток, пр-т 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН, зав. патентным отделом Н.И. Стадниченко

(72) Автор(ы): Ковалевская А.М. (RU), Стоник В.А. (RU), Авилов С.А. (RU), Гришин Ю.И. (RU) (73) Патентообладатель(и): Тихоокеанский институт биоорганической химии Дальневосточного отделения РАН (RU)

(54) СРЕДСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ ПРОФИЛАКТИЧЕСКИМ И ЛЕЧЕБНЫМ ДЕЙСТВИЕМ ПРИ ЗАРАЖЕНИИ ВИРУСОМ КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА

Изобретение относится к области медицины, а именно к экспериментальной вирусологии, и может быть использовано для профилактики и лечения вирусного клещевого энцефалита.

Наиболее известным средством предупреждения заражения клещевым энцефалитом являются вакцины, представляющие собой инактивированные вирусы [1]. Недостатки известного средства заложены уже в самой схеме вакцинации: для впервые вакцинируемых требуется три инъекции, выполняемые с определенным интервалом в первый год, и затем по одной инъекции в последующие два года или раз в два года, в зависимости от вида вакцины. Такие растянутые сроки свидетельствуют о слабом индуцировании иммунитета и иммунологической памяти. Но самый главный недостаток заключается в том, что ни одна вакцина, тем более убитая моноштаммовая, не может обладать надежным защитным эффектом в связи с выраженной гетерогенностью популяции вируса клещевого энцефалита, которая в настоящее время насчитывает около 200 штаммов. Заболевают привитые, когда антигенная характеристика штамма не соответствует таковой у вакцинного штамма.

Известна серопрофилактика и серотерапия, где в качестве средства против клещевого энцефалита используются иммунные сыворотки. Серотерапия оказывает негативное влияние на активный иммуногенез, выражающееся в депрессии функции В-лимфоцитов, снижении синтеза и накоплении вирус-нейтрализирующих антител и антигемагглютининов, персистенции вируса [2]. Серотерапия при очаговых формах клещевого энцефалита показана только в детском и молодом возрасте, у лиц старше 40 лет серопрепараты оказывают негативное действие. При менингиальной форме клещевого энцефалита на фоне специфической иммунотерапии чаще наблюдаются летальные исходы.

Известен специфический человеческий иммуноглобулин для профилактики и лечения клещевого энцефалита, используемый в практическом здравоохранении. Однако препарат имеет недостаточную эффективность, ограниченное производство и характеризуется отсутствием иммуностимулирующего эффекта [3].

Приведенные аналоги не решают проблему борьбы с клещевым энцефалитом, о чем свидетельствуют высокая смертность, стойкие остаточные явления, длительный реабилитационный период и необходимость использования неспецифических лекарственных средств, дополняющих специфическое лечение (противовоспалительные, дезинтоксикационные, дегидратирующие, противогистаминные, десенсибилизирующие, седативные, общеукрепляющие, рассасывающие и другие препараты).

Наиболее близким по назначению и достигаемому эффекту к заявляемому средству является химиотерапевтический препарат 4-йодантипирин [4]. В экспериментальном клещевом энцефалите при дозе препарата 50 мг/кг живого веса и двукратном введении его за 24 и за 1 час до заражения профилактический эффект достигает 47%. В лечебной схеме при введении 50 мг/кг йодантипирина в течение 11 дней ежедневно защитный эффект составляет 60% при введении через рот и 53,4% при парэнтеральном способе применения. ЛД₅₀ (доза, вызывающая гибель 50% животных) и максимально переносимая доза (МПД) этого препарата составляют 1000 мг/кг и 500 мг/кг, соответственно. Следует заметить, что вирусный штамм Абсеттаров, с которым работали при исследовании известного средства, характеризуется пониженной патогенностью.

Недостатками известного средства являются непродолжительность профилактического эффекта и высокая токсичность препарата, которая вообще характерна для большинства химических препаратов. Так, действующая доза 50 мг/кг в 20 раз отличается от летальной, а максимально переносимая - 500 мг/кг - только в 2 раза. Кроме того, доза 50 мг/кг сама по себе является очень большой. В расчете на человека среднего веса (60 кг) на один прием требуется 3 г лекарства. Использование таких больших доз увеличивает вероятность нежелательных побочных эффектов и идет вразрез с тенденциями современной фармакологии, стремящейся к максимальному снижению доз препаратов за счет их высокой эффективности.

Поэтому поиск эффективных и малотоксичных средств для профилактики и лечения вирусного клещевого энцефалита является в настоящее время актуальной задачей.

Указанная задача решена применением препарата КД в качестве средства, обладающего профилактическим и лечебным действием при заражении вирусом клещевого энцефалита.

Препарат КД или кукумариозид представляет собой сумму тритерпеновых гликозидов и получен из доступного природного сырья, а именно из отвара голотурии Cucumaria japonica [5]. Известно применение препарата КД в ветеринарии в качестве иммуномодулирующего и биостимулирующего средства [6], в качестве средства для профилактики и лечения алеутской болезни норок [7] и в качестве средства для лечения лучевой болезни [8]. Известно также применение кукумариозида в качестве средства, обладающего активностью против вирусов везикулярного стоматита, полиомиелита, энцефаломиокардита мышей, Коксаки А₇ и B₇, герпеса, болезни Нью-Кастла и аденовируса [9].

Применение препарата КД (кукумариозида) в качестве средства для профилактики и лечения клещевого энцефалита обнаружено авторами впервые.

Новая функция кукумариозида не вытекает с очевидностью из его известных свойств и состава. Активность кукумариозида в опытах in vitro против нескольких вышеперечисленных вирусов не означает то, что препарат непременно будет обладать и активностью против вируса клещевого энцефалита. Отсутствие подобной зависимости подтверждается литературными данными [10] и нашими собственными экспериментами.

Технический результат достигается за счет пролонгированного действия препарата КД при профилактическом применении и чрезвычайно низких доз препарата, требуемых для достижения сопоставимых с прототипом эффектов, что обусловлено его исключительно высокой активностью. Так в экспериментах на мышах при введении кукумариозида в дозе 3,5×10^-3 мкг/кг за 7 дней до заражения индекс защиты составляет 57%, при введении через 24 и 48 часов после заражения в той же дозе индекс защиты равняется 44%.

ЛД₅₀ для мышей при внутрибрюшинном введении составляет 29 мг/кг. Цитогенетическая оценка мутагенного действия показала, что в микроядерном тесте в полихроматофильных эритроцитах костного мозга мышей среднее число микроядер не отличается от контроля; при учете структурных нарушений хромосом в клетках костного мозга метафазы со структурными аберрациями хромосом не отличаются от контроля. Следует заметить, что все работы проводились со штаммом Николаенко, изолированным в 1978 г. из мозга умершего от клещевого энцефалита и обладающим высокой церебральной и периферической активностями при заражении мышей. Поэтому работа с высоковирулентным штаммом Николаенко, выделенным в Приморском крае, имеет большое значение в связи с особенностями клинических проявлений клещевого энцефалита в этом регионе: тяжелым течением инфекции и высокой летальностью, достигающей в отдельные годы 25-30%.

Изобретение расширяет арсенал средств заявленного назначения.

Пример. Определение противовирусной активности препарата КД проводили на нелинейных белых мышах массой 14 г по общепринятой методике [11]. Мышей инфицировали путем внутрибрюшинного введения вируса клещевого энцефалита (штамм Николаенко) в количестве 10 ЛД₅₀ в объеме 0,2 мл физиологического раствора. Титр вируса был равен 2 Ig ЛД₅₀/0,2 мл.

Кукумариозид вводили подкожно 1 раз в сутки в дозах 3,5×10^-4, 3,5×10^-3, 3,5×10^-2 и 3,5×10^-1 мкг/кг в 0,2 мл физиологического раствора. На каждое определение брали по 20 мышей.

Проведено 3 серии испытаний противовирусной активности: в первой серии исследовали профилактическое применение заявляемого средства - кукумариозид вводили однократно за 7 дней до заражения мышей вирусом клещевого энцефалита. Во второй серии проводили одновременное введение кукумариозида и вируса. В третьей серии проводили исследование лечебного эффекта кукумариозида, осуществляя однократное введение кукумариозида через 24 часа после заражения и двукратное введение препарата через 24 и 48 часов после заражения.

Все серии опытов сопровождались контролем (группы неинфицированных мышей, которым вводили кукумариозид, а также группы инфицированных вирусом клещевого энцефалита мышей, не подвергавшихся лечебному или профилактическому воздействию испытуемого препарата).

Срок наблюдения за всеми животными 21 день.

Эффективность действия препарата КД характеризовали индексом защиты (ИЗ), который рассчитывали по формуле:

где

К₃ - коэффициент защиты, вычисленный по формуле:

Результаты испытаний приведены в таблице.

В результате экспериментов подобрана наиболее эффективная доза препарата КД - 3,5×10^-3 мкг/кг. Выявлено значительное снижение летальности мышей, зараженных высоковирулентным штаммом Николаенко, при применении кукумариозида по профилактической и лечебной двукратной схемам. Так при введении за 7 дней до заражения в дозе 3,5×10^-3 мг/кг кукумариозид дает индекс защиты 57%. При введении кукумариозида дважды через 24 и 48 часов после заражения в той же дозе индекс защиты составляет 44%. Одновременное с заражением применение кукумариозида не дает заметного защитного эффекта (не более 20%), к тому же реализация такой схемы практически невозможна в реальных условиях.

Таким образом, заявляемое средство в профилактической схеме превосходит прототип как по длительности эффекта, так и по величине (57% за 7 суток до заражения для заявляемого средства и 47% за сутки до заражения для прототипа), и достаточно активно в лечебной схеме. Большим преимуществом препарата КД является его чрезвычайно низкая токсичность в применяемых дозах (отличается от ЛД₅₀ в 10⁶ раз), а также пролонгированное профилактическое действие против вируса клещевого энцефалита, что избавляет от необходимости ежедневного приема противовирусного препарата.

Источники информации

1. Леонова Г.Н. Клещевой энцефалит в Приморском крае. -Владивосток - 1997. - С.165-179.

2. Переходова С.К., Дуринова В.П., Шматко В.Г. и др. в кн. Природно-очаговые болезни (вопросы лабораторной диагностики, эпидемиологии и профилактики). - Омск, 1982. - С.56-62.

3. RU 2158606 С1, А 61 К 39/395, А 61 Р 31/0027, 10.11.2000.

4. RU 2025126 С1, А 61 К 31/41, 30.12.1994.

5. RU 2110522 С1, С 07 Н 3/06, 10.05.1998.

6. ТУ 9388-018-02698170-94 на препарат КД (кукумариозид). Зарегистрированы Приморским центром стандартизации и метрологии №035/001357 от 05.05.1994.

7. RU 2036654 С1, А 61 К 35/78, 09.06.1990.

8. RU 2141833 С1, А 61 К 35/56, 27.11.1999.

9. RU 2184556 С1, А 61 К 35/56, А 61 Р 31/12, 10.07.2002.

10. R.Pompei, O.Flore, M.A.Marccialis, A.Pani, B.Loddo.//Nature/ - 1979 - Vol.281. - P.689

11. Оценка специфического действия антивирусных веществ при экспериментальных вирусных энцефалитах. - Бел. НИИ эпидемиологии и микробиологии Минздрава БССР. - 1986.

Формула изобретения

Применение препарата КД в качестве средства, обладающего профилактическим и лечебным действием при заражении вирусом клещевого энцефалита.