РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА ПО ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ, ПАТЕНТАМ И ТОВАРНЫМ ЗНАКАМ	(19) RU (11) 2 196 604 (13) C1
	(51) МПК A61K 38/08 (2000.01)

Статус:	не действует (последнее изменение статуса: 22.12.2021)
Пошлина:	учтена за 12 год с 22.12.2012 по 21.12.2013. Патент перешел в общественное достояние.

(21)(22) Заявка: 2001134536/14, 21.12.2001 (24) Дата начала отсчета срока действия патента: 21.12.2001 (45) Опубликовано: 20.01.2003 Бюл. № 2 (56) Список документов, цитированных в отчете о поиске: ЛУЦЕНКО С.В. и др. Российский онкологический журнал. - 2001, № 3, С.33-37. US 5349066 A, 20.09.1994. RU 98107656 A, 27.01.2000. RU 2129018 C1, 20.04.1999. RU 2107690 C1, 27.03.1998. RU 2157701 C1, 20.10.2000. Адрес для переписки: 113149, Москва, Симферопольский б-р, 8, МНИИМЭ

(71) Заявитель(и): Московский научно-исследовательский институт медицинской экологии (72) Автор(ы): Киселев С.М., Луценко С.В., Северин Е.С., Северин С.Е., Фельдман Н.Б. (73) Патентообладатель(и): Северин Евгений Сергеевич, Северин Сергей Евгеньевич, Луценко Сергей Викторович

(54) ПОЛИПЕПТИД, ЯВЛЯЮЩИЙСЯ АНАЛОГОМ РЕЦЕПТОРСВЯЗЫВАЮЩЕГО ФРАГМЕНТА ЭПИДЕРМАЛЬНОГО ФАКТОРА РОСТА С 21-Й ПО 31-Ю АМИНОКИСЛОТУ, ЕГО КОНЪЮГАТ С ДОКСОРУБИЦИНОМ И ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ НА ЕГО ОСНОВЕ

Предлагаемое изобретение относится к области химии природных соединений, фармакологии и медицине и может быть использовано в медицине для лечения онкологических больных.

Среди главных причин, существенно ограничивающих эффективность противоопухолевой химиотерапии, можно выделить первичную и приобретенную резистентность опухолевых клеток к лекарственным препаратам, а также низкую избирательность их действия. Повышение селективности химиопрепаратов может быть достигнуто посредством их направленного транспорта к клеткам-мишеням с помощью различных белковых векторов. При этом химиопрепараты попадают внутрь клетки в результате рецептор-опосредованного эндоцитоза конъюгата, представляющего собой ковалентно связанные векторный белок и химиопрепарат. Избирательность действия конъюгатов достигается либо за счет наличия на поверхности опухолевых клеток специфических рецепторов, "узнаваемых" векторным белком или антителом, либо за счет значительно более высокого уровня рецепторов векторного белка на поверхности опухолевых клеток по сравнению с нормальными. Возможность эффективного использования эпидермального фактора роста (ЭФР) в качестве векторной молекулы обусловлена его высокой стабильностью, доступностью в виде рекомбинантного белка, а также значительно более высоким содержанием ЭФР-рецепторов на поверхности опухолевых клеток по сравнению с нормальными.

Известно большое число работ и патентов, посвященных различным конъюгатам на основе ЭФР с доксорубицином (ДР) и другими противоопухолевыми препаратами, способам их получения, фармацевтических композиций на их основе [пат США 5824805, 5349066, 5087616, 5393737, 5505931, 5622929, 5122368, 5776458 и др.].

Доксорубицин (ДР) - известный противоопухолевый антибиотик - несмотря на широкое клиническое применение имеет ряд существенных недостатков, к числу которых относятся высокая кардиотоксичность и быстро развивающаяся резистентность опухолевых клеток при повторных внутривенных инъекциях антибиотика. Применение ДР в составе конъюгата могло бы значительно улучшить его терапевтические свойства.

Особый интерес представляет использование коротких пептидных фрагментов ЭФР в качестве векторных молекул для доставки ДР (и др. противоопухолевых средств) и других противоопухолевых лекарств в опухолевые клетки-мишени. Поскольку технология их получения относительно проста, экономична и не предполагает использования биологического сырья для их производства. Конъюгаты, созданные на их основе, легче поддаются стандартизации.

Известно использование для химиотерапии рака смесей (фармацевтических композиций) ДР (и др. противоопухолевых средств) и различных пептидных фрагментов ЭФР [пат. США 4863902]. Усиление противоопухолевого действия патентуемых препаратов авторы объясняют более высокой чувствительностью опухолевых клеток к действию ДР на фоне стимуляции клеточной пролиферации, опосредованной ЭФР и его активными фрагментами.

Однако нековалентная иммобилизация ДР с пептидными фрагментами ЭФР и ЭФР не гарантирует его целенаправленную доставку к опухолевым клеткам-мишеням и повышает тем самым неспецифическую токсичность препарата.

Известно также использование в терапии рака биологически активного циклического полипептида, имеющего аминокислотную последовательность, аналогичную последовательности с 32-й по 48-ю аминокислоту ЭФР [пат. США 5183805]. В описании указано, что пептид может быть химически конъюгирован с химиотерапевтическими агентами, такими как ДР, однако конъюгаты в формуле изобретения не заявлены, нет описания их получения, не указаны их биологические свойства.

Прототипом заявляемого изобретения является полипептид - фрагмент эпидермального фактора роста с 21-й по 31-ю аминокислоту (H₂N-MYIEALDKYAC-СООН), способный эффективно связываться с рецептором ЭФР и вызывать пролиферацию клеток, конъюгат его с ДР в соотношении 1:1, в котором конъюгированные части соединены азометиновой кислотолабильной связью с помощью глутарового альдегида, в качестве сшивающего агента [конъюгат и полипептид описаны коллективом авторов предлагаемого изобретения: Российский онкологический журнал, 3, 2001 г., с. 33-37, "Увеличение цитотоксической активности доксорубицина при его транспорте в опухолевые клетки с помощью белковых векторов"] . В качестве прототипа для фармацевтической композиции могут быть взяты любые композиции, описанные в пат. США 5349066, 5087616, 5122368, содержащие конъюгаты ДР с ЭФР в эффективном количестве и подходящий для внутривенного введения фармацевтический носитель.

Изобретательской задачей является расширение арсенала средств данного назначения, а также увеличение эффективности их действия.

Задача решается тем, что предлагается новый полипептид, являющийся аналогом фрагмента эпидермального фактора роста с 21-й по 31-ю аминокислоту, способного эффективно связываться с рецептором эпидермального фактора роста, вызывать пролиферацию клеток и выполнять функцию вектора для направленной доставки противоопухолевых препаратов в опухолевые клетки. Полипептид имеет структуру:
H₂N-MYIEALDSYAC-COOH (II)
В отличие от полипептида-прототипа в патентуемом полипептиде аминокислота Lys, находящаяся в активном центре рецепторсвязывающего фрагмента человеческого ЭФР заменена на Ser, - одну из аминокислот, формирующих центр связывания в мышином ЭФР. Как установлено, замена Lys на Ser позволила избежать нежелательного конъюгирования по ε-аминогруппам лизина в активном центре рецепторсвязывающего фрагмента, что в свою очередь позволило избежать ингибирования связывания полипептида с рецептором ЭФР.

Эффективность нового полипептида показана на основе известного антибиотика доксорубицина, однако могут быть использованы также другие противопухолевые антибиотики, такие как винкристин, цисплатин, дауномицин, метотрексат, а также другие известные противоопухолевые средства: токсины, такие как дифтерийный или рицин, циклофосфамид и др.

1. Предлагается также конъюгат полипептида с доксорубицином, в котором доксорубицин ковалентно присоединен к полипептиду через кислотолабильную азометиновую связь, а в качестве полипептида он содержит полипептид формулы MYIEALDSYAC, обладающий избирательным действием в отношении раковых опухолей и способный значительно снижать резистентность опухолевых клеток к противоопухолевым препаратам.

В качестве сшивающего агента по аминогруппам полипептида и доксорубицина может быть использован глутаровый альдегид, а также другие известные бифункциональные агенты. В результате получают конъюгат с кислотолабильной химической связью.

Предметом настоящего изобретения является также фармацевтическая композиция, обладающая противоопухолевым действием на основе предлагаемого конъюгата рецепторсвязывающего фрагмента эпидермального фактора роста с доксорубицином в эффективном количестве (0.05-0.1%) и приемлемых носителей для внутривенного введения.

При этом носителем может быть физиологический раствор, фосфатно-солевой раствор, обезболивающие препараты. Композиция также может содержать дополнительно противомикробные, противовирусные и противопаразитарные средства, а также другие препараты, применяемые для лечения онкологических больных, в количестве не более 50 вес.% от общего веса композиции.

Ниже приведены примеры, иллюстрирующие предлагаемое изобретение и доказывающие возможность использования рецепторсвязывающего фрагмента эпидермального фактора роста, предлагаемого конъюгата и композиции на его основе по указанному назначению.

Пример 1. Получение полипептида.

Полипептид был получен методом твердофазной пептидной химии с использованием Fmoc стратегии синтеза. В качестве полимерного носителя была выбрана смола Wang-resin. На каждом шаге пептидной конденсации карбоксильную группу Fmoc-аминокислот активировали превращением в гидроксибензотриазоловый эфир с помощью HOBt и N.N-диизопропилкарбодиимида. Fmoc-аминокислоты, HоBt и N.N-диизопропилкарбодиимид вводили в реакцию в 10-кратных молярных избытках по отношению к аминогруппам полимера. За ходом реакции следили по изменению окраски бромфенолового синего, который добавляли в реактор в виде раствора в диметилсульфоксиде (ДМСО) в соотношении 1/1000 (мол.) к количеству аминогрупп. Реакция длилась 1.5-2 ч. После завершения конденсации смолу промывали 4 раза диметилформамидом (ДМФ) и обрабатывали 50% раствором пиперидина в ДМФ. Отщепление полипептида от полимерного носителя проводили смесью трифторуксусной кислоты - 95%; воды - 2.5%; 1,2-этандитиола - 2.5%. После того, как смола была отфильтрована, пептид высаживали из раствора диэтиловым эфиром. Осадок отделяли центрифугированием, высушивали в вакууме и анализировали методом обращеннофазовой ВЭЖХ(ОФВЭЖХ) на колонке Phenomenex Luna C18 250*3. Градиентное элюирование полипептида с колонки проводили в системе растворителей: ацетонитрил - 0.1% трифторуксусная кислота/вода. Полупрепаративная ОФ ВЭЖХ проводилась в тех же условиях на колонке Nucleosil С18 250*8. Чистота полипептида после хроматографического разделения составила >96%.

Полипептид был охарактеризован методом масс-спектрометрии (молекулярный ион - 1265). Структура полипептида приведена в табл. 1.

Пример 2. Получение конъюгата полипептида с ДР.

Полипептид растворяли в 5 мл 0.05М фосфатного буфера (рН 7) (концентрация 1 мг/мл) и добавляли доксорубицин, предварительно растворенный в 5 мл дистиллированной воды (pH 5.5) (концентрация 1.2 мг/мл). Синтез конъюгата осуществляли по схеме 1 (см. в конце описания). К реакционной смеси при перемешивании добавляли по каплям глутаровый альдегид (ГА) в 0.05М фосфатном буфере (pH 7.2) ( концентрация ГА -0.5 мг/мл). Объем добавленного раствора ГА составил 3 мл. После добавления ГА смесь инкубировали в течение 1 ч при 50^oС. Синтезированный конъюгат отделяли от исходных веществ на колонке PD-10 Sephadex G-25 (Pharmacia, Sweden). Конъюгат анализировали методом ОФ ВЭЖХ на колонке Nucleosil С18 250*4.6. Градиентное элюирование конъюгата с колонки проводили в системе растворителей: ацетонитрил-0.1% трифторуксусная кислота/вода.

Концентрацию полипептида в конъюгате определяли спектрофотометрически (длина волны λ =280 нм). Содержание ДР в конъюгате определяли спектрофотометрически при длине волны λ =495 нм. Молярное соотношение полипептид:ДР в конъюгате составляет 1:1.

Таким образом, разработана методика химического конъюгирования предлагаемого полипептида и доксорубицина с помощью глутарового альдегида в качестве сшивающего агента. Получен и охарактеризован конъюгат полипептид-ДР, в котором соотношение конъюгированных частей составляет 1:1.

Пример 3. Биологическая активность полипептида.

Определение пролиферативной активности полипептида проводили на клетках фибробластов мыши линии NIH 3Т3. Интенсивность биосинтеза ДНК определяли по включению ³Н-тимидина в кислоторастворимую фракцию клеток.

Клетки линии фибробластов мыши линии NIH 3Т3 культивировали в пластиковых флаконах (Costar) в среде RPMI (Sigma), содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки (Sigma), 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина, в увлажненной атмосфере 5% СО₂ при 37^oС. Пролиферацию синхронизированных фибробластов линии NIH 3Т3 индуцировали, добавляя к суспензии клеток полипептид в различных концентрациях (0.1-1000 нг/мл). Фибробласты культивировали в 96-луночных планшетах в 200 мкл среды по 200-800 тысяч/лунку в полной среде. ³Н-тимидин (1мкКи/лунку, 40 мКи/моль) вносили за 2 ч до окончания инкубации. Радиоактивность клеток измеряли на жидкостном сцинтилляционном счетчике (Rackbeta, LKB) с использованием сцинтилляционной жидкости ЖС-8 на основе толуола. Интенсивность биосинтеза ДНК выражали в виде индекса стимуляции (отношение стимулированных клеток к контрольным) по формуле I= N/N₀x100%, где I - индекс стимуляции, N - число стимулированных ЭФР клеток, N₀ - число контрольных клеток.

На фиг. 1 представлены сравнительные данные о влиянии предлагаемого полипептида и прототипа (ЭФРфр) на пролиферацию клеток фибробластов мыши линии NIH 3Т3. Эти данные демонстрируют более выраженный дозозависимый пролиферативный эффект полипептида в отношении данной линии клеток, чем у прототипа, что может свидетельствовать о более высокой эффективности взаимодействия полипептида с рецептором. Поскольку экспрессия рецепторов к ЭФР на несколько порядков превышает таковую на нормальных клетках организма, данный факт подтверждает возможность использования предлагаемого полипептида в качестве более эффективной векторной молекулы (по сравнению с прототипом) для доставки противоопухолевых препаратов в опухолевые клетки.

Пример 4. Эффективность конъюгата полипептида с доксорубицином в отношении опухолевых клеток различных линий, оцениваемая по выживаемости.

Действие конъюгата было исследовано на следующих линиях клеток: карцинома молочной железы человека линии MCF-7^Wt и резистентная линия карциномы молочной железы человека MCF-7^AdrR; карцинома яичника человека линии SKOV3 и резистентная линия карциномы яичника человека SKVLB; мышиная меланома линии В16.

Протокол испытаний был общим для всех проведенных испытаний и состоял в следующем: клетки культивировали в пластиковых флаконах (Costar) в среде RPMI (Sigma), содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки (Sigma), 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина, в увлажненной атмосфере 5% СО₂ при 37^oС. Клетки рассевали в 96-луночные планшеты (Costar) по 10 тысяч клеток/лунку, добавляя исследуемые препараты в различных концентрациях, и инкубировали 72 ч. За 2-4 ч до окончания инкубации в каждую лунку добавляли по 50 мкл раствора (1 мг/мл) МТТ (3-[4,5-диметилтиазол-2-уl]-2,5-дифенилтетразолия бромид, Sigma) в среде для культивирования клеток. После развития окраски среду удаляли, растворяли кристаллы формазана в 150 мкл диметилсульфоксида и спектрофотометрически измеряли интенсивность окраски по поглощению при 540 нм. Выживаемость клеток, подвергшихся воздействию ДР и конъюгата, оценивали в процентах, принимая за 100% выживаемость контрольной культуры.

Данные о выживаемости клеток после их инкубации с конъюгатом полипептид-ДР, свободным доксорубицином, а также конъюгатом ЭФРфр-ДР приведены в табл. 2. Из представленных данных следует, что предлагаемый конъюгат полипептида с доксорубицином оказывает значительно более высокое токсическое действие в отношении опухолевых клеток человека линий MCF-7^Wt и SKOV3, чувствительных к доксорубицину, а также в отношении клеток мышиной меланомы В16, чем свободный ДР и его конъюгат с ЭФРфр (прототип). Конъюгат полипептид-ДР также проявлял высокую цитотоксическую активность в отношении клеток линий MCF-7^AdrR и SKVLB, обладающих резистентностью к антрациклиновым антибиотикам. Таким образом, показано, что противоопухолевый препарат (доксорубицин) в составе конъюгата с предлагаемым полипептидом проявляет значительное цитотоксическое действие в отношении опухолевых клеток, как чувствительных, так и резистентных в отношении доксорубицина, что доказывает эффективность предлагаемого полипептида в качестве векторной молекулы для доставки противоопухолевых средств в условиях in vitro.

Пример 5. Фармацевтические композиции для инъекций получают растворением конъюгата в физрастворе или фосфатно-солевом растворе. рН растворов около 7,4. Концентрация конъюгата в растворе составляет 0,05-0.1%.

Пример 6. Противоопухолевая активность композиции конъюгата полипептид-ДР с физиологическим раствором (по примеру 5) на модели перевиваемых опухолей мышей.

Для сравнительной оценки терапевтической активности конъюгата полипептид-ДР в отношении солидных опухолей, полученных подкожным введением мышам опухолевых клеток линии В16, использовали внутривенный способ введения композиций, описанных в примере 5. Полученные результаты представлены на фиг. 2 и в табл. 3. Препараты вводили в дозах 0,2 мг/кг по ДР по схеме один раз в 4 дня, всего три инъекции, начиная с 3-го дня после прививки опухоли.

Из фиг. 2 следует, что конъюгат, в отличие от свободного ДР, значительно замедлял время появления опухолей и скорость их роста. Торможение роста опухолей составило 58%.

Из табл. 3 следует, что заявляемый конъюгат позволяет получить терапевтический эффект при внутривенном способе введения препарата, который оценивался по увеличению продолжительности жизни (УПЖ) животных. Применение конъюгата приводило к 46%-ному УПЖ, чего не наблюдалось в случае свободного ДР.

Увеличение средней продолжительности жизни животных, а также более высокие показатели ингибирования роста опухоли подтверждают терапевтическую эффективность направленной доставки противопухолевого агента в составе предлагаемой композиции в условиях in vivo.

Показано (примеры 4, 6), что конъюгат предлагаемого полипептида с антибиотиком антрациклинового ряда доксорубицином (полипептид-ДР) обладает терапевтической эффективностью в отношении солидных опухолей при внутривенном способе введения. Для оптимизации действия конъюгата будет отработана специальная схема и выбраны дозы введения препарата.

Формула изобретения

1. Биологически активный полипептид формулы MYIEALDSYAC, способный связываться с рецептором эпидермального фактора роста, вызывать пролиферацию клеток и выполнять функцию векторной молекулы для направленной доставки противоопухолевых препаратов в опухолевые клетки.

2. Конъюгат полипептида с доксорубицином, в котором доксорубицин ковалентно присоединен к полипептиду через кислотолабильную азометиновую связь, а в качестве полипептида он содержит полипептид формулы MYIEALDSYAC.

3. Конъюгат полипептида с доксорубицином по п. 2. , в котором доксорубицин ковалентно присоединен к полипептиду с применением глутарового альдегида в качестве сшивающего агента.

4. Фармацевтическая композиция, обладающая противоопухолевым действием, содержащая конъюгат доксорубицина с векторной молекулой в эффективном количестве и подходящий для внутривенного введения фармацевтический носитель, отличающаяся тем, что в качестве конъюгата доксорубицина она содержит его конъюгат с полипептидом формулы MYIEALDSYAC.

ИЗВЕЩЕНИЯ

MM4A Досрочное прекращение действия патента из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 22.12.2013

Дата публикации: 27.09.2014