РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА ПО ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ	(19) RU (11) 2 468 087 (13) C1
	(51) МПК C12Q 1/04 (2006.01) A61K 35/74 (2006.01)

Статус:	не действует (последнее изменение статуса: 10.02.2024)
Пошлина:	учтена за 9 год с 10.08.2019 по 09.08.2020. Возможность восстановления: нет.

(21)(22) Заявка: 2011133426/10, 09.08.2011 (24) Дата начала отсчета срока действия патента: 09.08.2011 Приоритет(ы): (22) Дата подачи заявки: 09.08.2011 (45) Опубликовано: 27.11.2012 Бюл. № 33 (56) Список документов, цитированных в отчете о поиске: ШЕВЕЛЕВА С.А., БАТИЩЕВА С.Ю., КУВАЕВА И.Б. Использование имитационной модели пищеварения в комплексной оценке пробиотических штаммов. Материалы Международного конгресса "Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Фундаментальные и клинические аспекты". Санкт-Петербург, 15-16 мая 2007 г в рамках 9-го Международного Славяно-Балтийского научного форума. Пробиотики и функциональное питание. Санкт-Петербург "Гастро-2007". реф.265, А 74-А 75. Методические рекомендации. Оценка безопасности наноматериалов. 9.10.2. Изучение выживаемости микроорганизмов-пробиотиков в присутствии наноматериалов на моделях in vitro, имитирующих условия пищеварения в организме ребенка и взрослого. Утв. приказом Роспотребнадзора от 12.10.2007 № 280. М., 2007. RU 2415674 С2, 10.04.2011. DUNNE C.et al. Probiotic from myth to relity. Demonstration of functionality in animal models of disease and in human clinical trials. Antonie van Leeuwenhoek. 1999, v.76, p.279-292. Адрес для переписки: 610000, г.Киров-обл., ул.Московская, 36, оф.323, ФГБОУ ВПО "ВятГУ", ОИС, Н.А. Овсянниковой

(72) Автор(ы): Дармов Илья Владимирович (RU), Чичерин Игорь Юрьевич (RU), Ердякова Анна Сергеевна (RU), Погорельский Иван Петрович (RU), Лундовских Ирина Александровна (RU) (73) Патентообладатель(и): Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Вятский государственный университет" (RU)

(54) СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ЖИЗНЕСПОСОБНЫХ ПРОБИОТИЧЕСКИХ МИКРООРГАНИЗМОВ В УСЛОВИЯХ IN VITRO, ИМИТИРУЮЩИХ ПРОЦЕСС ПИЩЕВАРЕНИЯ У ЧЕЛОВЕКА

Изобретение относится к области медицины и медицинской микробиологии и может быть использовано для изучения выживаемости пробиотических микроорганизмов в модельных средах, содержащих ферментные препараты, аналогичные таковым в желудке и кишечнике человека.

Дисбактериозы превратились в актуальную проблему медицины (Токарева Н. Коррекция и профилактика дисбактериоза / Н.Токарева // Эффективная фармакотерапия. Гастроэнтерология. - 2011. - №3. - С.77-85). Клинически доказано, что почти 90% населения России в различной степени страдает дисбактериозом. Множественность причин дисбактериозов, к которым можно добавить стрессы различного генеза, снижение иммунного статуса, ксенобиотики, нарушение биоритмов, ятрогенные воздействия и т.д., проявляющихся качественными и количественными нарушениями нормальной микрофлоры, являются основой многочисленных клинических выражений болезни, симптомокомплексов, расстройств в работе и функционировании тех или иных органов и систем человеческого организма.

В профилактике и лечении дисбактериозов наряду с патогенетическим лечением, строгим соблюдением диеты, нормализацией моторики кишечника, «функциональным» питанием, селективной деконтаминацией нежелательной микрофлоры, консультацией с психотерапевтом основной упор сделан на применение пробиотических препаратов, производство которых поставлено на коммерческую основу. Многолетний опыт применения таких препаратов показал их потенциальные возможности в коррекции либо предотвращении дисбактериозов (Микроэкологические нарушения при клинической патологии и их коррекция бифидосодержащими пробиотиками / А.А.Воробьев [и др.] // Вестник РАМН. - 2004. - №2. - С.13-17). Однако клиницисты с сожалением констатируют, что положительный эффект пробиотиков даже при длительном применении носит временный (транзиторный) характер. В научной литературе приводятся клинические наблюдения о низком эффекте (либо его отсутствии) применения пробиотиков при некоторых дисбиотических состояниях различного происхождения (Утимурадова Г.Э. Этиология острых кишечных инфекций у детей и эффект пробиотикотерапии / Г.Э.Утимурадова // Журн. микробиол. - 2009. - №3. - С.80-100; Минушкин О.Н. Дисбактериоз кишечника (понятие, диагностика, принципы лечебной коррекции). Современные возможности пребиотической терапии. Учебно-методическое пособие для врачей и курсантов циклов усовершенствования врачей / О.Н.Минушкин [и др.] // М.: ФГУ «Учебно-методический центр» управления делами Президента Российской Федерации, 2010. - 50 с.). В качестве одной из главных причин низкой эффективности пробиотиков называют высокую вероятность чужеродности пробиотических микроорганизмов для больного, которому они предназначаются. В ряде случаев некоторые штаммы бифидобактерий и молочнокислых бактерий могут выступать в качестве оппортунистических патогенных агентов. Кроме того, длительное и в больших дозах применение пробиотических препаратов (Бифидумбактерина, Лактобактерина и др.) может спровоцировать развитие дисбиотических изменений в популяциях аэробных и микроаэрофильных организмов кишечной микрофлоры (Лесняк С.В. О свойствах препаратов из нормальной микрофлоры человека / С.В.Лесняк, Л.Н.Евтухова, Л.Ф.Шимчук // Антибиотики и микроэкология человека и животных / С.М.Навашин, Б.А.Шендеров. - М.: Медицина, 1988. - С.136-140).

С практической точки зрения очень важным является состояние колонизационной резистентности кишечника больного, определяющей сроки приживления пробиотических микроорганизмов и их лечебный эффект (или отсутствие такового) (Глушанова Н.А. Взаимоотношение пробиотических и индигенных лактобацилл хозяина в условиях совместного культивирования in vitro / Н.А.Глушанова, Б.А.Шендеров // Журн. микробиол. - 2005. - №2. - С.56-61). Сама же колонизационная резистентность напрямую связана с биологическими свойствами как пробиотических микроорганизмов, так и представителей индигенной микрофлоры. Именно индигенная кишечная микрофлора определяет конкурентоспособность или совместимость с микроорганизмами пробиотиков.

В связи с серьезностью проблемы дисбактериоза еще в 1997 г. А.А.Воробьевым с соавторами (Дисбактериозы - актуальная проблема медицины / А.А.Воробьев [и др.] // Вестник РАМН. - 1997. - №3. - С.4-7) в качестве актуальной проблемы здравоохранения названа проблема комплексной профилактики и терапии дисбактериозов, включающая патогенетическое и этиотропное лечение основного заболевания в сочетании с заместительной терапией пробиотиками, а также иммуностимуляторами различной направленности. Новым и весьма оригинальным способом нормализации кишечной микрофлоры является стимуляция собственной индигенной микрофлоры с использованием фруктоолигосахаридов и фруктополисахаридов и содействие приживлению пробиотических микроорганизмов при их пероральном применении (Захаренко С.М. Инфекции, микробиота кишечника человека и метаболический синдром / С.М.Захаренко, Ю.А.Фоминых, С.Н.Мехтиев // Эффективная фармакотерапия. Гастроэнтерология. - 2011. - №3. - С.14-20). В этой связи весьма важно знать то количество пробиотических микроорганизмов, которое достигло толстого кишечника, поскольку именно биотический потенциал пробиотических микроорганизмов всецело будет зависеть от критической численности их популяции, гарантирующей размножение (воспроизведение) видов микроорганизмов. В то же время до настоящего времени не решен вопрос о выживаемости пробиотических микроорганизмов при их пероральном применении в ходе пассажа через пищеварительный тракт, что предопределяет необходимость проведения микробиологических исследований в данном направлении.

Несмотря на достаточно большой арсенал методов, которые могут быть использованы в оценке состояния кишечной микрофлоры (ПЦР-диагностика, хромато-масс-спектрометрия, исследования микробных метаболитов), все еще приоритетными остаются методы бактериологического исследования, которые являются наиболее близкими к заявляемому способу. Разработанные Р.В.Эпштейн-Литвак и Ф.Л.Вильшанской еще в 1970 г. (http://mfvt.ru/sovremennye-metody-diagnostiki-disbacterioza-kishechnica [Электронный ресурс] // Медико-фармацевтический Вестник Татарстана. Научно-практический журнал «Прикладная медицина») бактериологические методы претерпели ряд изменений. В зависимости от оснащения микробиологической лаборатории количество определяемых показателей может достигать 25. Основным достоинством методов бактериологического исследования кала больных является точная идентификация патогенных и условно-патогенных бактерий семейства кишечных (Enterobacteriaceae). Однако результаты исследования зависят от соблюдения сроков транспортировки биологического материала, его консервации, качества используемых для посева питательных сред.

Бактериологические методы исследования кала имеют ряд общеизвестных недостатков, в том числе низкую чувствительность и возможность получения ложноположительных и ложноотрицательных результатов, которые объясняются неоднородностью видового состава выделяемых микроорганизмов из каловых масс, формируемых в различных отделах кишечника, трудностью культивирования, в частности анаэробных микроорганизмов и т.д. Это и многое другое требует проведения многократных и длительных исследований для выявления определенных тенденций изменения состава микробиоценоза. Кроме того, с использованием бактериологических методов определяется преимущественно внутрипросветная (полостная) и наряду с ней транзиторная (пассажная) микрофлора, которая является доминирующей. При этом основная часть микрофлоры, так называемая пристеночная микрофлора, не оценивается.

Особо следует подчеркнуть, что судьба и количество введенных перорально пробиотических микроорганизмов остаются неизвестными. Об их лечебной эффективности врач судит по таким симптомам у больного дисбактериозом, как вздутие и урчание в животе, изменение стула, патологические примеси в кале, боль в животе. Если симптомы отсутствуют, делается вывод об эффективности пробиотикотерапии. При сохранении перечисленных симптомов в течение 2 недель приема пробиотического препарата больному назначается новый пробиотический препарат. Однако смена пробиотического препарата совершенно не гарантирует наличие пробиотического эффекта. Врач, назначая новый пробиотический препарат, не знает о выживаемости в кишечнике входящих в его состав микроорганизмов и о возможной колонизации слизистой кишечника, поскольку при постановке исследований такого плана в настоящее время очень трудно воссоздать естественные условия обитания микроорганизмов.

Информативными являются микробиологические исследования микроорганизмов с применением анаэробного культивирования в биоптатах, полученных из различных отделов кишечника (Ардатская М.Д. Дисбактериоз кишечника: эволюция взглядов. Современные принципы диагностики и фармакологической коррекции / М.Д.Ардатская, О.Н.Минушкин // Consilium medicum / Приложение. Гастроэнтерология. - 2006. - №2. - С.4-18). Однако в силу технических сложностей метод анаэробного культивирования в биоптатах в практической медицине не может быть использован.

В последние годы разработан и внедрен в практику новый способ диагностики состояния микробиоценоза различных биотопов, в том числе кишечника, основанный на определении короткоцепочечных жирных кислот, являющихся метаболитами в основном анаэробных родов микроорганизмов (Сравнительная оценка клинико-лабораторной эффективности современных про- и пребиотических препаратов в коррекции дисбиотических нарушений желудочно-кишечного тракта: отчет о клинико-лабораторном исследовании / ФГУН «Московский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н.Габричевского»; рук. Грачева Н.М., Ардатская М.Д.; исполн. Аваков А.А., Соловьева А.И. - М.: 2010. - 23 с.). Указанный способ прошел регистрацию в Минздравсоцразвития РФ (номер регистрационного удостоверения ФС-2006/030-у от 17.03.2006 г.), внедрен в клиническую практику и лабораторную диагностику, что позволяет быстро и точно оценить состояние индигенной микрофлоры, но не пробиотических микроорганизмов при пероральном их поступлении.

В 90-е годы прошлого столетия были предприняты попытки внедрения в клиническую практику хроматографических (газожидкостная, ионообменная, высокоэффективная жидкостная хроматография) методов определения метаболитов индигенной микрофлоры (Минушкин О.Н. Дисбактериоз кишечника: современные аспекты изучения проблемы, принципы диагностики и лечения (обзор) / О.Н.Минушкин, М.Д.Ардатская, А.В.Дубинин // Терапевтический архив. - 2001. - №2. - С.67-72). Однако они характеризовались трудоемкостью и несовершенством методики пробоподготовки, что приводило к потере до 20% метаболитов, высокой стоимостью оборудования и др.

Частично эти недостатки устраняет способ того же назначения, описанный Шевелевой и др. «Использование имитационной системы пищеварения в комплексной оценке пребиотических штаммов» Материалы Международного конгресса «Пробиотики, пребиотики синбиотики и функциональные продукты питания. Фундаментальные и клинические аспекты. Санкт-Петербург, 15-16 мая 2007 г. в рамках 9 Международного Славяно-Балтийского научного форума. Пробиотики и функциональное питание Санкт-Петербург-Гастро реф.265 А-74-А-75. Известный способ включает исходное определение количества пребиотических микроорганизмов, подлежащих исследованию, последующую инкубацию в условиях, имитирующие процесс пищеварения у человека, повторное определение количества живых микроорганизмов, сравнение числовых значений количества микроорганизмов в начале и конце опыта и вынесение суждения по результатам сравнения

Этот известный способ согласно цитированному источнику информации позволяет приблизить процесс определения жизнеспособности микроорганизмов к естественным условиям. Однако в источнике информации не раскрыты режимы проведения инкубации, состав сред, моделирующих процесс исследования, что не позволяет не только сделать вывод о преимуществах способа перед известными, но и воспроизвести последний с получением указанного авторами результата. Приведенная в тезисах ссылка на непубликуемое авторское свидетельство не может рассматриваться как источник информации, в котором раскрыты условия воспроизведения способа.

Техническим результатом заявленного изобретения является повышение эффективности и точности способа выявления жизнеспособных пробиотических микроорганизмов путем максимального приближения условий его проведения к естественным за счет дополнительного использования ферментов, присущих соответствующим отделам пищеварительного тракта, а также за счет выбора более точного времени инкубирования. Кроме того, способ позволяет повысить точность определения жизнеспособности микроорганизмов за счет более полного освобождения суспензии микроорганизмов от кислой среды и более точного подсчета микроорганизмов путем предварительного высева их на плотную питательную среду.

Этот технический результат достигается тем, что в известном способе выявления жизнеспособных пробиотических микроорганизмов, включающем исходное определение их количества, последующую инкубацию в условиях, имитирующие процесс пищеварения у человека, повторное определение количества живых микроорганизмов, сравнение числовых значений количества микроорганизмов в начале и конце опыта и вынесение суждения по результатам сравнения число жизнеспособных микроорганизмов определяют после инкубирования пробиотических микроорганизмов в течение 4 часов в кислой модельной среде с ацидин-пепсином путем высева суспензии микроорганизмов на плотную питательную среду, подсчета выросших колоний и последующего определения числа жизнеспособных микроорганизмов, оставшуюся суспензию освобождают от среды инкубирования, к осадку добавляют щелочную модельную среду с панзинорм форте 20000 в объеме, аналогичном объему кислой модельной среды, ресуспендируют осадок и инкубируют суспензию в течение 12 ч, после чего определяют остаточное число жизнеспособных микроорганизмов путем высева на плотную питательную среду и подсчета выросших колоний.

Для получения кислой модельной среды с рН 2,0-2,2 можно смешать 89,1 мл 0,1 М раствора лимонной кислоты с 10,9 мл 0,2М раствора натрия фосфорнокислого двузамещенного.

Инкубирование пробиотических микроорганизмов можно проводить в кислой модельной среде с рН 2,0-2,2, содержащей дополнительно ацидин-пепсин 0,5 мг·мл^-1.

Для получения щелочной модельной среды с рН 7,0-7,2 можно смешать 17,6 мл 0,1 М раствора лимонной кислоты с 82,4 мл 0,2М раствора натрия фосфорнокислого двузамещенного.

Инкубирование пробиотических микроорганизмов можно проводить в щелочной модельной среде с рН 7,0-7,2, содержащей дополнительно панзинорм форте 20000 2,5 мг·мл^-1.

Т.о. технический результат, который может быть достигнут при использовании предлагаемого способа, заключается в том, что количественный состав пробиотических микроорганизмов и их жизнеспособность определяются в ходе последовательной инкубации микроорганизмов в кислой и щелочной модельных средах с соответствующими ферментными препаратами, имитирующих физиологические процессы пищеварения в желудочно-кишечном тракте человека. Установленные количественные значения жизнеспособных пробиотических микроорганизмов позволяют с высокой точностью судить о том, сколько в процентном отношении пробиотических микроорганизмов от исходной лечебной дозы, принятой внутрь, может достигнуть толстого кишечника, колонизировать его слизистую оболочку и оказать положительный эффект от заместительной терапии.

Известно, что средний размер (емкость) желудка человека 1,5-2,0 л. Желудочный сок обладает протеолитической активностью в широком диапазоне с двумя выраженными оптимумами: рН 1,5-2,0, при котором отмечается максимальная активность пепсина, и 3,2-3,5 - когда наиболее выражена активность гастрипсина. Эвакуация пищи из желудка после перемешивания с желудочным соком в двенадцатиперстную кишку (с изменением значений рН от 5,6-7,9 в луковице двенадцатиперстной кишки до 8,0-9,0 в тонкой и подвздошной кишке) зависит от температуры съеденной пищи, физического состояния и химического состава, а также от ее объема, но в целом время пребывания смешанной пищи в желудке взрослого составляет от 3 до 10 часов. С учетом консистенции съеденной пищи, ее состава и температуры, индивидуальных особенностей, скорости физиологических сокращений кишечника время продвижения перевариваемой пищи по тонкой и подвздошной кишке составляет в среднем 12 часов.

Способ выявления жизнеспособных пробиотических микроорганизмов, заключается в том, что в условиях in vitro определяют количество живых микроорганизмов в начале и конце опыта и сравнивают их численные значения. Для имитации физиолого-биохимических параметров, возникающих в процессе пищеварения в полости желудка и тонком кишечнике, применяют специальные модельные среды на основе цитратно-фосфатного буферного раствора со средними показателями кислотности желудочного и дуоденального сока в диапазоне 2,5-7,6 и добавляет ферментные препараты ацидин-пепсин и панзинорм форте 20000. Ацидин-пепсин обладает протеолитическими свойствами, повышает кислотность первой модельной среды; панзинорм форте 20000 компенсирует недостаточность внешнесекреторной функции поджелудочной железы за счет компонентов, входящих в его состав (ферментов липазы, амилазы и протеазы).

Пример 1.

Готовят цитратно-фосфатные буферные растворы с рН 2,5 (раствор №1) и 7,0 (раствор №2) с использованием 0,1М раствора лимонной кислоты (по ГОСТ 908-79) и 0,2М раствора натрия фосфорнокислого двузамещенного (Na₂HPO₄) (по ГОСТ 4172-76). Для получения раствора №1 смешивают 89,1 мл 0,1М раствора лимонной кислоты с 10,9 мл 0,2М раствора Na₂HPO₄; для получения раствора №2 смешивают 17,6 мл 0,1М раствора лимонной кислоты с 82,4 мл 0,2М раствора Na₂HPO₄. Оба раствора используют для приготовления модельных (кислой и щелочной) сред с ферментными препаратами. Кислую модельную среду с рН 2,0-2,2 готовят, добавляя к раствору №1 0,5 мг·мл^-1 ацидин-пепсина (производитель РУП «Белмедпрепараты», г.Минск, Беларусь); щелочную модельную среду с рН 7,0-7,2 готовят, добавляя к раствору №2 2,5 мг·мл^-1 ферментного препарата панзинорм форте 20000 (производитель ООО «КРКА-РУС», г.Истра, Московская область, Россия).

Модельные среды используют для инкубирования пробиотических микроорганизмов и определения их жизнеспособности (выживаемости). В центрифужную пробирку с крышкой вносят кислую модельную среду (раствор №1 с ацидин-пепсином) в расчетном количестве и добавляют пробиотический препарат, содержащий одну дозу микроорганизмов пробиотиков. Пробирку закрывают крышкой, встряхивают до растворения лиофилизированной массы пробиотика, после чего отбирают необходимое количество суспензии для определения исходного количества жизнеспособных микроорганизмов путем посева на плотную питательную среду в чашках Петри и подсчета выросших колоний. Центрифужную пробирку с регидратированной суспензией пробиотика и чашки Петри с посевом суспензии микроорганизмов помещают в термостат (в случае бифидо- и лактобактерий или других факультативных анаэробов - в систему для микроаэрофильного выращивания) для культивирования при температуре 37°С.

Через 4 часа инкубирования из центрифужной пробирки отбирают 0,1 мл суспензии для посева на плотную питательную среду в чашках Петри, инкубирования при температуре 37°С, подсчета выросших колоний и последующего определения числа жизнеспособных бактерий. Оставшуюся суспензию центрифугируют (10000 g, 15 мин) в центрифужной пробирке для осаждения микробных клеток. Надосадочную жидкость после центрифугирования удаляют. К осадку микробных клеток в центрифужной пробирке добавляют щелочную модельную среду (раствор №2 с панзинорм форте 20000) в объеме, аналогичном объему кислой модельной среды. После тщательного перемешивания суспензии в центрифужной пробирке с закрытой крышкой последнюю помещают на 12 часов в термостат при температуре 37°С. По прошествии срока инкубирования из суспензии в центрифужной пробирке делают высев на плотную питательную среду в чашках Петри для выращивания бактерий и подсчета количества выживших микроорганизмов. Подсчет выросших колоний пробиотических микроорганизмов на плотной питательной среде в чашках Петри проводят через 48 часов инкубации при температуре 37°С. На основании подсчета выросших колоний определяют количество живых микроорганизмов в одной дозе препарата, а также спустя 4 часа пребывания в кислой модельной среде и через 12 часов пребывания в щелочной модельной среде с соответствующими ферментными препаратами. Сопоставляют результаты и определяют количество жизнеспособных пробиотических микроорганизмов после их пребывания в модельных средах, имитирующих состав желудочного сока и секрета поджелудочной железы.

Пример 2.

Берут пробиотический препарат Бифидумбактерин, созданный на основе бифидобактерий B.bifidum №1. В 1 дозе препарата, согласно инструкции по применению, содержится не менее 10⁷ живых бактерий. Одну дозу препарата вносят в 2 мл кислой модельной среды с ацидин-пепсином в центрифужной пробирке, после чего регидратированную суспензию высевают на плотную питательную среду для определения числа жизнеспособных бактерий в начале опыта. После 4 часов инкубирования пробиотика в кислой модельной среде при температуре 37°С определяют число жизнеспособных бактерий в суспензии, центрифугируют суспензию (10000 g 15 мин) и к осадку добавляют 2 мл щелочной модельной среды с панзинорм форте 20000, ресуспендируют осадок и инкубируют суспензию 12 часов при температуре 37°С, после чего определяют число жизнеспособных бифидобактерий путем высева на плотную питательную среду в чашках Петри и подсчета числа выросших колоний. Результаты определения: исходное число жизнеспособных бифидобактерий в 1 дозе препарата 1,8·10⁷; после инкубирования в течение 4 часов в кислой модельной среде с ацидин-пепсином - 1,0·10⁴ живых бактерий; после инкубирования в течение 12 часов в щелочной модельной среде с панзинорм форте 20000 - 1,5·10³ живых бактерий, что составляет 0,008% от исходного количества бифидобактерий в 1 дозе препарата.

Пример 3.

Берут пробиотический препарат Колибактерин, созданный на основе кишечной палочки E.coli М-17. В 1 дозе препарата, согласно инструкции по применению, содержится не менее 10·10⁹ живых бактерий. Одну дозу препарата вносят в 2 мл кислой модельной среды с ацидин-пепсином в центрифужной пробирке, после чего регидратированную суспензию высевают на плотную питательную среду для определения числа жизнеспособных бактерий в начале опыта. После 4 часов инкубирования пробиотика в кислой модельной среде при температуре 37°С определяют число жизнеспособных бактерий в суспензии, центрифугируют суспензию (10000 g 15 мин) и к осадку добавляют 2 мл щелочной модельной среды с панзинорм форте 20000, ресуспендируют осадок и инкубируют суспензию 12 часов при температуре 37°С, после чего определяют число жизнеспособных бактерий кишечной палочки путем высева на плотную питательную среду в чашках Петри и подсчета числа выросших колоний. Результаты определения: исходное число жизнеспособных бактерий в 1 дозе препарата 10·10⁹; после инкубирования в течение 4 часов в кислой модельной среде с ацидин-пепсином - 2,9·10⁵ живых бактерий; после инкубирования в течение 12 часов в щелочной модельной среде с панзинорм форте 20000 - 1,0·10³ живых бактерий, что составляет 0,00001% от исходного количества кишечных палочек в 1 дозе препарата.

Пример 4.

Берут пробиотический препарат Споробактерин жидкий (суспензия для приема внутрь), содержащий бациллы B.subtilis 534. В 1 мл препарата, согласно инструкции по применению, содержится не менее 1·10⁹ живых бактерий. Препарат в объеме 1 мл вносят в 2 мл кислой модельной среды с ацидин-пепсином в центрифужной пробирке, после чего полученную суспензию высевают на плотную питательную среду для определения числа жизнеспособных бактерий в начале опыта. После 4 часов инкубирования пробиотика в кислой модельной среде при температуре 37°С определяют число жизнеспособных бактерий в суспензии, центрифугируют суспензию (10000 g 15 мин) и к осадку добавляют 2 мл щелочной модельной среды с панзинорм форте 20000, ресуспендируют осадок и инкубируют суспензию 12 часов при температуре 37°С, после чего определяют число жизнеспособных бактерий B.subtilis 534 путем высева на плотную питательную среду в чашках Петри и подсчета числа выросших колоний. Результаты определения: исходное число жизнеспособных бактерий в суспензии 1,6·10⁸; после инкубирования в течение 4 часов в кислой модельной среде с ацидин-пепсином - 1,7·10⁸ живых бактерий; после инкубирования в течение 12 часов в щелочной модельной среде с панзинорм форте 20000 - 1,8·10⁸ живых бактерий, что свидетельствует о полном сохранении жизнеспособности бактерий B.subtilis 534 в ходе пассажа через модельные среды.

Заявленный способ позволяет выявлять жизнеспособность пробиотических микроорганизмов в составе коммерческих пробиотических препаратов от отечественных и зарубежных производителей и прогнозировать количество жизнеспособных пробиотических микроорганизмов, поступающих в толстый кишечник при приеме внутрь препарата с лечебной или профилактической целью.

Формула изобретения

1. Способ выявления жизнеспособных пробиотических микроорганизмов, включающий исходное определение их количества, последующую инкубацию в условиях, имитирующих процесс пищеварения у человека, повторное определение количества живых микроорганизмов, сравнение числовых значений количества микроорганизмов в начале и конце опыта и вынесение суждения по результатам сравнения, отличающийся тем, что число жизнеспособных микроорганизмов определяют после инкубирования пробиотических микроорганизмов в течение 4 ч в кислой модельной среде с ацидин-пепсином путем высева суспензии микроорганизмов на плотную питательную среду, подсчета выросших колоний и последующего определения числа жизнеспособных микроорганизмов, оставшуюся суспензию освобождают от среды инкубирования, к осадку добавляют щелочную модельную среду с панзинорм форте 20000 в объеме, аналогичном объему кислой модельной среды, ресуспендируют осадок и инкубируют суспензию в течение 12 ч, после чего определяют остаточное число жизнеспособных микроорганизмов путем высева на плотную питательную среду и подсчета выросших колоний.

2. Способ выявления жизнеспособных пробиотических микроорганизмов по п.1, отличающийся тем, что для получения кислой модельной среды с рН 2,0-2,2 смешивают 89,1 мл 0,1 М раствора лимонной кислоты с 10,9 мл 0,2М раствора натрия фосфорнокислого двузамещенного.

3. Способ выявления жизнеспособных пробиотических микроорганизмов по п.1, отличающийся тем, что инкубирование пробиотических микроорганизмов проводят в кислой модельной среде с рН 2,0-2,2, содержащей дополнительно ацидин-пепсин 0,5 мг·мл^-1.

4. Способ выявления жизнеспособных пробиотических микроорганизмов по п.1, отличающийся тем, что для получения щелочной модельной среды с рН 7,0-7,2 смешивают 17,6 мл 0,1М раствора лимонной кислоты с 82,4 мл 0,2М раствора натрия фосфорнокислого двузамещенного.

5. Способ выявления жизнеспособных пробиотических микроорганизмов по п.1, отличающийся тем, что инкубирование пробиотических микроорганизмов проводят в щелочной модельной среде с рН 7,0-7,2, содержащей дополнительно панзинорм форте 20000 2,5 мг·мл^-1.

ИЗВЕЩЕНИЯ

MM4A Досрочное прекращение действия патента из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 10.08.2020

Дата внесения записи в Государственный реестр: 20.05.2021

Дата публикации и номер бюллетеня: 20.05.2021 Бюл. №14