РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА ПО ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ, ПАТЕНТАМ И ТОВАРНЫМ ЗНАКАМ |
(19)
RU
(11)
(13)
C2
|
|||||
|
||||||
| Статус: | не действует (последнее изменение статуса: 02.07.2021) |
| Пошлина: | учтена за 3 год с 20.01.2011 по 19.01.2012. Возможность восстановления: нет. |
|
(21)(22) Заявка: 2009101480/15, 19.01.2009 (24) Дата начала отсчета срока действия патента: Приоритет(ы): (22) Дата подачи заявки: 19.01.2009 (43) Дата публикации заявки: 27.07.2010 Бюл. № 21 (45) Опубликовано: 10.10.2011 Бюл. № 28 (56) Список документов, цитированных в отчете о поиске: КАМЫШОВА Е.С. Клиническое значение полиморфных маркеров гена ангеотензинпревращающего фермента, гена синтетазы альдостерона и гена эндотелиальной синтетазы оксида азота при хроническом гломерулонефрите. Автореферат дисс. к.м.н., 2004, 35 с. WO 03089659 А1, опубл. 30.10.2003. RU 94014574 А1, опубл. 10.08.1996. WATANABE Y. et al. Impact of selectin gene polymorphisms on rapid progression to end-stage renal disease in patients with IgA nephropathy. Impact of selectin gene polymorphisms on rapid progression to end-stage renal disease in patients with IgA nephropathy. Intern Med. 2006; 45(16), p.947-951. Epub, 2006, Sep.15. Найдено из БД PubMed, PMID: 16974056. ШЕСТАКОВ А.Е. Исследование ассоциации ряда генов-кандидатов с хроническим гломерулонефритом. Автореф. Дисс. к.м.н. - М., 2006, 25 с. Адрес для переписки: |
(72) Автор(ы):
(73) Патентообладатель(и):
|
(54) СПОСОБ ОЦЕНКИ ПОЧЕЧНОЙ ВЫЖИВАЕМОСТИ У БОЛЬНЫХ ХРОНИЧЕСКИМ ГЛОМЕРУЛОНЕФРИТОМ НА ОСНОВЕ ДАННЫХ О ПОЛИМОРФИЗМЕ ГЕНОВ ИНТЕРЛЕЙКИНОВ
(57) Реферат:
Способ относится к области медицины и может быть использовано для оценки почечной выживаемости у больных хроническим гломерулонефритом. Сущность способа: выделяют ДНК из периферической венозной крови, выявляют аллели и генотипы генов интерлейкинов. Вывод о снижении почечной выживаемости у больных хроническим гломерулонефритом делают в следующих случаях: - выявления носительства аллеля -889С гена интерлейкина 1А -889С/Т IL-1A или аллеля -592А гена интерлейкина 10 -592C/AIL-10; - выявления носительства аллеля -511Т гена интерлейкина 1В -511 С/Т IL-1B в сочетании с нефротическим синдромом на момент первого обследования и наличия артериальной гипертензии в течение ХГН; - выявления генотипа 4R/4R гена антагониста рецептора интерлейкина 1 VNTR IL-1Ra. Использование способа позволяет оценить дальнейшее течение хронического гломерулонефрита, что дает возможность в кратчайшие сроки определить клинический прогноз и стратегию терапии данного заболевания. 3 табл.
Изобретение относится к области медицинской диагностики, может быть использовано для прогнозирования течения хронического гломерулонефрита на протяжении всей жизни человека.
Основная задача молекулярно-генетического типирования локусов генов интерлейкинов - это определение единичных нуклеотидных замен в генах, которые вызывают изменения уровня продукции интерлейкинов, что может влиять на развитие хронического воспалительного процесса
В ряду паренхиматозных заболеваний почек гломерулонефрит занимает доминирующее место. Среди нефрологических заболеваний хронический гломерулонефрит (ХГН) составляет более 35% [1]. Очевидно, что это самый частый вид патологического процесса, который является одной из распространенных причин хронической почечной недостаточности, для лечения которой необходимы гемодиализ и пересадка почки [2]. Распространенность и заболеваемость терминальными стадиями хронической болезни почек неуклонно увеличивается в разных регионах мира [3]. Если в США в конце XX века более 340000 человек были включены в программы диализа или трансплантации почки, то уже к 2010 году ожидается значительное увеличение числа таких пациентов, которое может достигнуть 560000 человек [4].
Согласно экспериментальным и клиническим данным, важную роль в развитии ХГН играют интерлейкины и факторы роста [8]. Клинико-генетические работы, посвященные молекулярно-генетическим аспектам ХГН, в России немногочисленны и затрагивают в основном спектр генов вазоактивных гормонов [9], интегральных мембранных белков и некоторых интерлейкинов [6]. Исследования роли полиморфных маркеров ряда генов интерлейкинов в отношении ХГН до сих пор не проведены.
Авторами в доступной научно-медицинской и патентной литературе не обнаружен способ оценки почечной выживаемости у больных хроническим гломерулонефритом.
Задачей настоящего исследования является разработка способа оценки почечной выживаемости у больных хроническим гломерулонефритом на основе данных о полиморфизме генов интерлейкинов.
Технический результат использования изобретения - получение критериев оценки течения хронического гломерулонефрита, позволяющих в кратчайшие сроки определить клинический прогноз и стратегию терапии данного заболевания.
В соответствии с поставленной задачей был разработан способ оценки почечной выживаемости у больных хроническим гломерулонефритом на основе анализа полиморфизма генов интерлейкинов, заключающийся в выделении ДНК из периферической венозной крови, по результатам которого делают вывод о снижении почечной выживаемости у больных хроническим гломерулонефритом в случае выявления:
- носительства аллеля -889С гена интерлейкина 1А -889С/T IL-1A;
- аллеля -592А гена интерлейкина 10 -592С/A IL-10;
- носительства аллеля -511Т гена интерлейкина 1В -511 С/Т IL-1B в сочетании с нефротическим синдромом на момент первого обследования и наличия артериальной гипертензии в течение ХГН;
- генотипа 4R/4R гена антагониста рецептора интерлейкина 1 VNTR IL-1Ra.
Новизна и изобретательский уровень заключается в том, что из уровня техники не известна возможность определения особенностей течения хронического гломерулонефрита по наличию указанных выше аллелей и генотипов генов интерлейкинов.
Способ осуществляют следующим образом.
ДНК выделяют из образцов периферической венозной крови больных хроническим гломерулонефритом в 2 этапа. На первом этапе к 4 мл крови добавляют 25 мл лизирующего буфера, содержащего 320 мМ сахарозы, 1% тритон Х-100, 5 мМ MgCl2, 10 мМ трис-HCl (pH=7,6). Полученную смесь перемешивают и центрифугируют при 4°С, 4000 об/мин в течение 20 минут. После центрифугирования надосадочную жидкость сливают, к осадку добавляют 4 мл раствора, содержащего 25 мМ ЭДТА (pH=8,0) и 75 мМ NaCl, ресуспензируют. Затем прибавляют 0,4 мл 10% SDS, 35 мкл протеиназы К (10 мг/мл) и инкубируют образец при 37°С в течение 16 часов. На втором этапе из полученного лизата последовательно проводят экстракцию ДНК равными объемами фенола, фенол-хлороформа (1:1) и хлороформа с центрифугированием при 4000 об/мин в течение 10 минут. После каждого центрифугирования производят отбор водной фазы. ДНК осаждают из раствора двумя объемами охлажденного 96% этанола. Сформированную ДНК растворяют в бидистиллированной, деионизованной воде и хранят при -20°С. Выделенную ДНК затем подвергают полимеразной цепной реакции с использованием стандартных олигонуклеотидных праймеров. Полимеразная цепная реакция (ПНР) синтеза полиморфных локусов интерлейкина 1А -889С/Т IL-1A, интерлейкина 1В -511 С/Т IL-1B, антагониста рецептора интерлейкина 1 VNTR IL-1Ra, интерлейкина 10 -592С/А IL-10 выполняется в 12,5 мкл общего объема смеси, содержащей 33,5 мМ трис-HCl (рН=8,8), 1,25 мМ MgCl2, 0,5 мкг геномной ДНК, по 5 пМ каждого праймера, по 100 мкМ dATP, dGTP, dCTP, dTTP и 1 единицу активной Taq-полимеразы. Температурные режимы ПЦР и последовательности праймеров представлены в таблице 1. Амплификат, наработанный при ПЦР полиморфных локусов генов интерлейкинов, подвергают рестрикции (ПДРФ-анализ) путем добавления к 12,5 мкл амплификата 5 ед. активности рестриктазы и инкубируют в термостате при температуре 37°С в течение 16 часов. Причем для анализа полиморфизма гена интерлейкина 1B -511C/T IL-1B используют эндонуклеазу рестрикции Ava I “СибЭнзим”, для анализа полиморфизма гена интерлейкина 1А -889С/Т IL-1A используют эндонуклеазу рестрикции Bsp 19I “СибЭнзим”, для анализа полиморфизма гена интерлейкина 10 -592С/A IL-10 используют эндонуклеазу рестрикции RsaI “СибЭнзим”.
Продукты ПДРФ-анализа оцениваются путем разделения при помощи электрофореза в 2%-ном агарозном геле, приготовленном на основе ТВЕ-буфера, окрашенном раствором бромистого этидия (0,01%). В качестве электрофорезного буфера используют 1×TAE (трис-ацетатный буфер). Визуализация фореграмм осуществляется в темном боксе с трансиллюминатором фирмы UVP (Швеция). Фрагменты длиной 304 п.н. соответствовали аллелю -511Т, 190 и 114 п.н. - -511С, а 304, 190 и 114 п.н. выявлены у гетерозигот -511 СТ. Мутантный аллель -511Т обусловливает повышение продукции интерлейкина 1В и, соответственно, обладает провоспалительным эффектом.
Фрагменты длиной 99 п.н. соответствовали аллелю -889С гена -889Т/С IL-1A, 83 и 16 п.н. - аллелю -889Т, фрагменты длиной 99, 83 и 16 п.н. наблюдались у гетерозигот -889СТ. Дикий аллель -889С обусловливает повышение продукции интерлейкина 1А и, соответственно, обладает провоспалительным эффектом.
Фрагменты длиной 412 п.н. соответствовали аллелю -592С гена IL-10, 236 и 176 п.н. - аллелю -592А, фрагменты длиной 412, 236 и 176 п.н. наблюдались у гетерозигот -592СА. Мутантный аллель -592А обусловливает повышение продукции интерлейкина 10 и IgE и, соответственно, обладает противовоспалительным и атопическим эффектами.
Продукты VNTR-анализа оцениваются путем разделения при помощи электрофореза в 3%-ном агарозном геле, приготовленном на основе ТВЕ-буфера, окрашенном раствором бромистого этидия (0,01%). В качестве электрофорезного буфера используют 1×TAE (трис-ацетатный буфер). Визуализация фореграмм осуществляется в темном боксе с трансиллюминатором фирмы UVP (Швеция). В результате амплификации идентифицируют фрагменты ДНК длиной 240-595 п.н., с 2, 3, 4, 5 или 6 копиями тандемных повторов. Эти аллели обозначаются как 2R, 3R, 4R, 5R и 6R, соответствуют аллелям IL-1Ra 2, 3, 1, 4 и 5.
Формирование базы данных и статистические расчеты осуществлялись с использованием программы «STATISTICA 6.0». Для оценки соответствия наблюдаемого распределения генотипов ожидаемому, исходя из равновесия Харди-Вайнберга, использован критерий χ2, наблюдаемая гетерозиготность, ожидаемая гетерозиготность, индекс фиксации Райта. Взаимосвязи между количественными патогенетически значимыми признаками ХГН и полиморфизмами генов цитокинов изучали с помощью однофакторного и двухфакторного дисперсионного анализа. Влияние генетических и средовых факторов на почечную выживаемость изучали с помощью метода множительных оценок Каплан-Майера и регрессионной модели Кокса.
В качестве конкретного примера проведен анализ результатов наблюдений 238 больных хроническим гломерулонефритом. Пациенты включались в соответствующую группу больных только после установления диагноза заболевания, подтвержденного с помощью клинических и лабораторно-инструментальных методов обследования.
Монофакторный анализ почечной выживаемости с использованием регрессионной модели Кокса подтвердил, что наличие аллеля -889С гена IL-1A или аллеля -592А гена IL-10 или артериальной гипертензии на протяжении ХГН ухудшают почечную выживаемость (табл.1).
| Таблица 1 | |
| Монофакторный анализ влияния генетических и клинических факторов на почечную выживаемость у больных ХГН (регрессионная модель Кокса) | |
| Факторы | Влияние фактора на выживаемость (p) |
| Наличие аллеля -511Т гена IL-1B | 0 |
| Наличие аллеля -889С гена IL-1А | Снижение почечной выживаемости; р=0,05 |
| Наличие аллеля IL-1Ra*4 гена VNTR IL-1Ra | 0 |
| Наличие аллеля IL-1Ra*1 гена VNTR IL-1Ra | 0 |
| Наличие аллеля -703С гена IL-5 | 0 |
| Наличие аллеля 113Т гена IL-9 | 0 |
| Наличие аллеля -592А гена IL-10 | Снижение почечной выживаемости; р=0,05 |
| Наличие аллеля -4257А гена IL-13 | 0 |
| Мужской пол | 0 |
| Снижение функции почек на момент первого обследования | 0 |
| Наличие нефротического синдрома на момент первого обследования | 0 |
| Наличие артериальной гипертензии на протяжении ХГН | Снижение почечной выживаемости; р=0,01 |
Многофакторный регрессионный анализ подтвердил, что неблагоприятными прогностическими факторами является одновременно: носительство аллеля -511Т гена IL-1B (р=0,005), наличие нефротического синдрома на момент первого обследования (р=0,007), наличие артериальной гипертензии в течении ХГН (р=0,002).
| Таблица 2 | |
| Многофакторный анализ влияния генетических и клинических факторов на почечную выживаемость у больных ХГН (регрессионная модель Кокса) | |
| Факторы | Влияние фактора на выживаемость (р) |
| Наличие аллеля -511Т гена IL-1B | Снижение почечной выживаемости; р=0,005 |
| Наличие аллеля -889С гена IL-1А | 0 |
| Наличие аллеля IL-1Ra*4 гена VNTR IL-1Ra | 0 |
| Наличие аллеля IL-IRa*1 гена VNTR IL-1Ra | 0 |
| Наличие аллеля -703С гена IL-5 | 0 |
| Наличие аллеля 113Т гена IL-9 | 0 |
| Наличие аллеля -592А гена IL-10 | 0 |
| Наличие аллеля -4257А гена IL-13 | 0 |
| Снижение функции почек на момент первого обследования | 0 |
| Наличие нефротического синдрома на момент первого обследования | Снижение почечной выживаемости; р=0,007 |
| Наличие артериальной гипертензии на протяжении ХГН | Снижение почечной выживаемости: p=0,002 |
При исследовании длительности хронического гломерулонефрита до развития терминальной стадии хронической почечной недостаточности (ТХПН) в зависимости от генотипов VNTR-полиморфизма антагониста рецептора интерлейкина 1 (VNTR IL-1Ra) с использованием дисперсионного анализа (табл.3) установлено, что раньше всего терминальной стадии ХПН достигали индивидуумы с генотипом 4R/4R (р=0,04): у пациентов с данным генотипом ТХПН развивается через 5,99 лет против 8,25-11,50 лет при других генотипах по данному локусу. Степень влияния полиморфизма антагониста рецептора интерлейкина 1 (VNTR IL-1Ra) на характер прогрессирования ХГН, оцененная с использованием коэффициента детерминации, весьма существенна и составляет 10,31%.
| Таблица 3 | |||
| Время развития ТХПН от начала ХГН (лет) | |||
| Ген | Полиморфизм и его локализация в гене | Генотипы | Длительность заболевания до развития ТХПН (лет) |
| 2R/2R | 8,25±2,52 (4) | ||
| 2R/4R | 10,26±1,30(15) | ||
| VNTR | 2R/5R | 11,5±3,07 (4) | |
| IL-1Ra | (2 интрон) | 4R/4R | 5,99±0,83 (36) |
| 4R/5R | 10,05±2,90 (5) | ||
| p | 0,04 | ||
| h2, % | 10,31 | ||
Таким образом, самостоятельными факторами риска ускоренного падения функции почек являются следующие:
- носительство аллеля -889С гена IL-1 А,
- носительство аллеля -592А гена IL-10,
- наличие артериальной гипертензии на протяжении ХГН.
Неблагоприятное прогностическое значение имеет одновременное сочетание аллеля -511Т гена IL-1B, наличие нефротического синдрома на момент первого обследования и артериальная гипертензия в течение ХГН.
Генотип 4R/4R VNTR IL-1Ra ассоциирован с высокой скоростью развития терминальной стадии ХПН.
Литература
Формула изобретения
Способ оценки почечной выживаемости у больных хроническим гломерулонефритом, включающий выделение ДНК из периферической венозной крови, выявление аллелей и генотипов генов интерлейкинов, отличающийся тем, что делают вывод о снижении почечной выживаемости у больных хроническим гломерулонефритом в следующих случаях: выявлении носительства аллеля -889С гена интерлейкина 1А -889С/Т IL-1A или аллеля -511ИТ гена интерлейкина 10 -592С/А IL-10 или выявлении носительства аллеля -592A гена интерлейкина 1В -511 С/Т IL-1В в сочетании с нефротическим синдромом на момент первого обследования и наличия артериальной гипертензии в течение ХГН, или выявления генотипа 4R/4R гена антагониста рецептора интерлейкина 1 VNTR IL-1Ra.
ИЗВЕЩЕНИЯ
PD4A Изменение наименования, фамилии, имени, отчества патентообладателя
(73) Патентообладатель(и):
Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Белгородский государственный национальный исследовательский университет» (RU)
Дата публикации: 10.04.2012
MM4A Досрочное прекращение действия патента из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе
Дата прекращения действия патента: 20.01.2012
Дата публикации: 20.11.2012