РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА ПО ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ, ПАТЕНТАМ И ТОВАРНЫМ ЗНАКАМ	(19) RU (11) 2 398 234 (13) C1
	(51) МПК G01N 33/49 (2006.01)

Статус:	не действует (последнее изменение статуса: 02.07.2021)
Пошлина:	Возможность восстановления: нет.

(21)(22) Заявка: 2009125268/15, 01.07.2009 (24) Дата начала отсчета срока действия патента: 01.07.2009 (45) Опубликовано: 27.08.2010 Бюл. № 24 (56) Список документов, цитированных в отчете о поиске: ГУЩИНА Ю.Ю. Подготовка биологических препаратов для сканирующей зондовой микроскопии: влияние способа фиксации на морфологические параметры клеток http://www.ntmdt.ru:8111/SPM-Techniques/SPM-Methodology/Preparation_blood_cells/text254 1998-2009. ФЕДОРОВА М.З. и др. Использование атомно-силовой микроскопии для оценки морфометрических показателей клеток крови. Биофизика, 2008, Т.53, вып.6, с.1014-1018. ГУЩИНА Ю.Ю. Исследование морфологии поверхности клеток Azotobacter chroococcum в условиях гипертермии методом атомно-силовой микроскопии // Поверхность. Рентгеновские, синхронные и нейронные исследования. 2005 №5 С.87-92. УСАНОВ Д.А. и др. Исследование поверхности материалов методом сканирующей атомно-силовой микроскопии. Учебное пособие. Саратов: Из-во Саратовский университет. 2007. с.23. RU 2314806 С1 (ИХФ РАН), 20.01.2008. SUGIURA Т. et al. Nanomanipulation and nanotechnology for future diagnostics. Stud Health Technol Inform. 2008; 134:135-42. PMID: 18376041, реф. PubMed, [он-лайн], [08.02.2009]. TRACHE A. et al. Atomic force microscopy (AFM). Curr Protoc Microbiol. 2008 Feb; Chapter 2: Unit 2C.2. PMID: 18770536, реф., PubMed, [он-лайн], [08.02.2009]. Адрес для переписки: 308015, г.Белгород, ул. Победы, 85, Белгородский государственный университет, ОИС, Н.Д. Цуриковой

(72) Автор(ы): Федорова Марина Зотовна (RU), Чернявских Светлана Дмитриевна (RU), Скоркина Марина Юрьевна (RU), Сладкова Евгения Анатольевна (RU), Забиняков Никита Александрович (RU) (73) Патентообладатель(и): Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Белгородский государственный университет" (RU)

(54) СПОСОБ ИССЛЕДОВАНИЯ НАТИВНЫХ КЛЕТОК

Способ исследования нативных клеток относится к области физиологии и морфологии клетки, и может быть использован для изучения живых клеток крови методом атомно-силовой микроскопии (АСМ).

В области современной зондовой микроскопии используются разные способы сканирования клеток крови с помощью атомно-силового микроскопа. Известны способы исследования клеток крови [1], основанные на приготовлении мазков стандартными способами, либо при нанесении суспензии предварительно фиксированных клеток на предметные стекла, с последующим сканированием их в воздушной среде, при сканировании в жидкостных ячейках методами контактной и полуконтактной АСМ. Недостатком этого способа является исследование неживых, фиксированных клеток, предварительно обработанных химическими реагентами, которые искажают их морфометрические параметры. Жидкостные ячейки, используемые в зондовых микроскопах для сканирования клеток, не позволяют получить объективные результаты, так как подготовка образцов требует прочной адгезии клеток к подложке. Обработка клеточных поверхностей химическими агентами (например, полилизином, ионами Са²⁺ и др.), вызывает разрушение или активацию клеточных структур и искусственное искажение их формы. Кроме того, в процессе сканирования возможно «сталкивание» с подложки клеток крови острием зонда или их прилипание к кантилеверу. Все это затрудняет получение сканов и объективных данных о форме и размерах клеток.

Наиболее близким по своей сущности к заявляемому является способ подготовки биологических препаратов для сканирующей зондовой микроскопии [2]; включающий сканирование методом поуконтактной АСМ гемоцитов фиксированных метанолом или глутаровым альдегидом. Для этого производят забор крови и стабилизацию ее антикоагулянтом - гепарином, выделение клеток крови - нейтрофилов, нанесение суспензии клеток в растворе Хенкса, содержащем ионы Са²⁺, на предметное стекло и инкубацию в течение 60 мин при 24°С, в ходе которой происходит адгезия нейтрофилов к стеклянной подложке, сканирование нативных клеток в жидкой среде с применением полуконтактного метода, используя в процессе сканирования в жидкости предварительно затупленный кантилевер серии CSG 11 жесткостью 0,03 Н/м, с резонансной частотой 15-40 KHz, радиусом закругления 50-60 нм и высотой щупа 10-20 мкм. В результате сканирования получают сканы 20 клеток и измеряют их параметры с помощью программного обеспечения для компьютерной морфометрии.

Недостатком описанного способа является фиксация клеток, которая искажает их нативную форму и размеры [2]. Кроме того, длительность приготовления препарата, модификация клеточной поверхности раствором Хенкса, содержащим ионы Са²⁺, создает опасность искусственных искажений формы клеток. Сканы, полученные при сканировании в жидкости, дают низкое пространственное разрешение [3], а значит не позволяют наблюдать характер повреждений клеточной мембраны. Использование гепарина в качестве антикоагулянта создает условия для появления возможных артефактов при сканировании клеточной поверхности, поскольку молекула гепарина, обладая сильными кислотными свойствами, несет отрицательный заряд [4], следовательно, модифицирует мембрану и создает дополнительные условия для взаимодействия клеточной поверхности с острием щупа.

Использование кантилевера серии CSG 11 жесткостью 0,03 Н/м, резонансной частотой 15-40 KHz приводит к взаимодействию его с поверхностью клетки. В результате клетка прикрепляется к щупу, отрывается от подложки и не удается отсканировать ее поверхность.

Задачей предлагаемого изобретения является создание способа исследования нативных клеток, который позволил бы проводить объективную оценку их геометрических параметров без воздействия на мембраны модифицирующих агентов, а также способа, исключающего механическое воздействие на поверхность клетки.

Для достижения указанного технического результата в способе, включающем:

- забор крови и стабилизацию ее антикоагулянтом - гепарином;

- выделение клеток крови (нейтрофилов);

- адгезию их к стеклянной подложке путем нанесения суспензии клеток в растворе Хенкса, содержащем ионы Са²⁺, на предметное стекло и инкубацию в течение 60 мин при 24°С;

- сканирование нативных клеток в жидкой среде с применением полуконтактного метода;

- сканирование осуществляют в жидкости, в процессе которого используют предварительно затупленный кантилевер серии CSG 11 жесткостью 0,03 Н/м, длиной балки 50 мкм, резонансной частотой 15-40 KHz, с радиусом закругления 50-60 нм и высотой щупа 10-20 мкм;

- получение сканов 20 клеток и измерение их параметров с помощью программного обеспечения для компьютерной морфометрии;

предлагается внести следующие изменения:

- использовать кровь без добавления антикоагулянта, которую суспендируют в физиологическом растворе;

- готовить препарат путем нанесения суспензии с живыми клетками на предметное стекло в виде капли, без механического воздействия на нее;

- сканировать нативные клетки, используя влажную камеру для поддержания их нативной формы, при этом помещать подложку с живыми клетками в камеру, насыщенную парами воды и закрытую мембраной;

- проводить сканирование в парах воды в полуконтактном режиме, используя кантилевер серии NSG 03 с жесткостью 0,4 Н/м, длиной балки 100 мкм и резонансной частотой в пределах 62-123 KHz;

- получить сканы на воздухе с высоким пространственным разрешением, не менее 30 клеток крови.

Предлагаемый способ позволит получить объективные данные о геометрических параметрах (размерах и форме) нативных клеток, за счет исключения модифицирующих воздействий антикоагулянта, веществ, усиливающих адгезию клеток к подложке, исключения механического воздействия на клетку в процессе приготовления препарата, использования влажной камеры, создающей оптимальные условия для сохранения нативной формы клеток, и получать сканы клеток с высоким разрешением, кроме того, предлагаемый способ позволит сократить время исследования.

Отличительными признаками заявленного способа являются:

- отсутствие воздействий модифицирующих агентов на клеточную поверхность в виде антикоагулянтов и веществ, усиливающих адгезию клеток к подложке (например, гепарин, полилизин, Са²⁺);

- использование нативных нефиксированных образцов крови в виде суспензии с живыми клетками, которые не подвергают распластыванию их по поверхности с помощью шлифовального стекла, таким образом исключая механическое воздействие на клетки;

- использование влажной камеры для создания условий, обеспечивающих сохранение нативного функционально активного и морфологически неизменного состояния клеток в течение времени, достаточного для сканирования образцов;

- сканирование в среде, насыщенной водными парами, что позволяет создавать оптимальное микроокружение для клеток, поддерживать их жизнеспособность, кроме того, сокращает время исследования и настройки прибора;

- использование для сканирования в полуконтактном режиме кантилевера серии NSG 03 с жесткостью 0,4 Н/м, длиной балки 100 мкм, резонансной частотой в пределах 62-123 KHz, что позволяет свести к минимуму взаимодействия щупа с поверхностью клетки, в результате чего исключается ее механическое повреждение.

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом. Готовят суспензию клеток путем нанесения ее на предметное стекло, помещают предметное стекло с препаратом во влажную камеру, насыщенную водными парами, проводят сканирование в парах жидкости в полуконтактном режиме, используя кантилевер серии NSG 03 с жесткостью 0,4 Н/м и длиной балки 100 мкм и резонансной частотой в пределах 62-123 KHz, получают сканы 30 клеток, измеряют геометрические параметры клеток с помощью программного обеспечения для компьютерной морфометрии.

Для сравнения различных модифицирующих воздействий на клеточную морфологию был проведен сравнительный анализ геометрических параметров клеток крови, отсканированных во влажной камере и в жидкостной ячейке.

Пример 1. Способ исследования нативных клеток во влажной среде.

Производят забор крови человека без добавления гепарина, суспендируют клетки крови в физиологическом растворе, суспензию в виде капли наносят на чистое обезжиренное предметное стекло. Помещают препарат во влажную камеру, представляющую собой чашу, насыщенную водными парами, которую сверху накрывают мембраной с отверстием для держателя щупа. Устанавливают влажную камеру с образцом на предметный столик микроскопа. Проводят сканирование в парах воды в полуконтактном режиме, используя кантилевер серии NSG 03 с жесткостью 0,4 Н/м, длиной балки 100 мкм и резонансной частотой в пределах 62-123 KHz. Получают сканы не менее 30 клеток, которые сохраняют. На сохраненных изображениях проводят измерения геометрических параметров клеток крови с использованием программ компьютерной морфометрии.

Предлагаемый способ позволяет получать сканы с высоким пространственным разрешением (фиг.1).

Пример 2. Сканирование клеток крови в жидкостной ячейке.

Готовят мазок крови человека путем нанесения капли крови на предметное стекло и распластывая ее по поверхности с помощью шлифовального стекла. Для адгезии клеток к подложке фиксируют мазок 2-3 мин в метиловом спирте. Помещают мазок в жидкостную ячейку, прилагаемую к атомно-силовому микроскопу, заполненную физиологическим раствором. Сканирование производят по предлагаемому способу, но в водной среде, с использованием кантилевера марки NSG 03 с жесткостью 0,4 Н/м, длиной балки 100 мкм. Получают сканы 30 клеток, которые сохраняют (фиг.2). На полученных сканах проводят измерения геометрических параметров клеток.

Сравнительные результаты измерений представлены в таблице 1.

Таблица 1
Морфометрические параметры клеток крови при разных условиях сканирования
Условия сканирования	Диаметр, мкм	Высота клетки, мкм	Объем, мкм3
Нативные клетки во влажной камере	7,396±0,14	0,483±0,02	31,960±1,78
Фиксированные клетки в жидкостной ячейке	7,139±0,07	0,892±0,02	62,750±2,01

Как видно из представленных данных, геометрические параметры клеток, отсканированных во влажной камере и жидкостной ячейках, различаются. Различия обнаружены по высоте клеток. Высота клеток, отсканированных во влажной камере, почти в 2 раза снижена по сравнению с клетками, отсканированными в жидкостной ячейке. Наблюдаемые различия связаны с модифицирующим воздействием фиксаторов, усиливающих адгезию клеток к подложке, а также с низким разрешением сканов, получаемых в жидкостной ячейке.

Предлагаемый способ изучения нативных клеток технически прост, позволяет в парах воды сохранять жизнеспособность, нативные размеры и форму биологических объектов. Предлагаемый способ может быть использован в общей и клинической физиологии для любых живых организмов и биологических объектов.

Литература

1. Зайцев Б.Н. Изучение клеток крови // www.ntmdt.ru.

2. Гущина Ю.Ю., Плескова С.Н. Подготовка биологических препаратов для сканирующей зондовой микроскопии: влияние способа фиксации на морфологические параметры клеток крови // www.ntmdt.ru.

3. Nowakowski R, Luckham P, Winlove P. Imaging erythrocytes under physiological conditions by atomic force microscopy // Biochim. Biophys Acta. - 2001. - V.1. - P.1514 (2) - 1706.

4. Зубаиров Д.М. Биохимия свертывания крови. - М.: Медицина, 1978. - 174 с.

Формула изобретения

1. Способ исследования нативных клеток, включающий забор крови, приготовление образцов крови, сканирование клеток в режиме полуконтактной атомно-силовой микроскопии, измерение геометрических параметров клеток, отличающийся тем, что образец готовят из суспензии нативных клеток путем нанесения капли на чистое обезжиренное предметное стекло, помещают образец во влажную камеру, насыщенную парами воды и закрытую мембраной, проводят сканирование в парах воды в полуконтактном режиме, используя кантилевер с резонансной частотой в пределах 62-123 KHz, получают сканы на воздухе с высоким пространственным разрешением.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что для приготовления образца используют суспензию клеток без антикоагулянта.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что для изготовления влажной камеры используют пластиковую чашку, прикрытую мембраной с отверстием для держателя щупа и заполненную парами жидкости.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что в результате сканирования получают сканы не менее чем 30 клеток.

ИЗВЕЩЕНИЯ

PD4A Изменение наименования, фамилии, имени, отчества патентообладателя

(73) Патентообладатель(и):
Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Белгородский государственный национальный исследовательский университет» (RU)

Дата публикации: 10.04.2012

---

MM4A Досрочное прекращение действия патента из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 02.07.2011

Дата публикации: 10.07.2012