РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА ПО ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ, ПАТЕНТАМ И ТОВАРНЫМ ЗНАКАМ |
(19)
RU
(11)
(13)
C1
|
|||||
|
||||||
| Статус: | не действует (последнее изменение статуса: 02.07.2021) |
| Пошлина: | учтена за 3 год с 22.04.2011 по 21.04.2012. Возможность восстановления: нет. |
|
(21)(22) Заявка: 2009115303/14, 21.04.2009 (24) Дата начала отсчета срока действия патента: (45) Опубликовано: 27.06.2010 Бюл. № 18 (56) Список документов, цитированных в отчете о поиске: ПЕТРОСЯН Э.К. Клинико-патогенетическое значение полиморфизма генов при гломерулярных болезнях у детей: Автореф. дис. на соиск. учен. степ. д-ра мед. наук, 2007, 45 с. RU 2302633 C1, 10.07.2007. UA 22358 U, 25.04.2007. UA 70904 A, 15.10.2004. ПЕТРОСЯН Э.К. и др. Роль генетического полиморфизма интерлейкинов 4 и 13 в развитии нефротического синдрома с минимальными изменениями у детей подростков. - Педиатрия, №5, 2006, с.7-10. ШЕСТАКОВ А.Е. Исследование ассоциации ряда генов-кандидатов с хроническим гломерулонефритом: Автореф. дис. на соиск. учен. степ. канд. мед. наук, 2006, 24 с. KITCHING A. R. et al. Endogenous IL-13 Limits Humoral Responses and Injury in Experimental Glomerulonephritis but Does Not Regulate Thl Cell-Mediated Crescentic Glomerulonephritis, J. Am Soc Nephrol. 2004, Sep; 15(9):2373-82, (реферат), [он-лайн], [найдено 10.11.2009], найдено из базы данных PubMed. Адрес для переписки: |
(72) Автор(ы):
(73) Патентообладатель(и):
|
(54) СПОСОБ ОЦЕНКИ ОСОБЕННОСТЕЙ КЛИНИЧЕСКОГО ТЕЧЕНИЯ ХРОНИЧЕСКОГО ГЛОМЕРУЛОНЕФРИТА
(57) Реферат:
Изобретение относится к области медицины. Для оценки особенностей клинического течения хронического гломерулонефрита выделяют ДНК из периферической венозной крови больных хроническим гломерулонефритом. В случае выявления генотипа 4257АА гена IL-13 делают вывод о вероятности формирования тяжелой артериальной гипертензии и высокого уровня среднесуточной протеинурии в течение заболевания. В случае выявления аллеля 4257А гена IL-13 делают вывод о вероятности протекания хронического гломерулонефрита с умеренной протеинурией. Способ позволяет в кратчайшие сроки осуществить прогнозирование течения хронического гломерулонефрита и определить стратегию терапии данного заболевания. 3 табл.
Изобретение относится к области медицинской диагностики, может быть использовано для прогнозирования течения хронического гломерулонефрита на протяжении всей жизни человека.
В настоящее время хронический гломерулонефрит (ХГН) представляет серьезную проблему современной медицины в связи с тяжестью болезни и широкой распространенностью в разных регионах мира [1]. В нашей стране ежегодно с диагнозом хронический гломерулонефрит госпитализируется около 1-2% от всех терапевтических больных. В структуре всей почечной патологии, составляющей около 200 случаев на 100 тыс. населения, ХГН является наиболее частым заболеванием, доля которого достигает 40% [2]. Следует отметить, что заболевание поражает преимущественно лица трудоспособного возраста, что наносит значительный социальный и экономический ущерб [3]. ХГН нередко приводит к летальности в связи с достижением терминальной стадии хронической почечной недостаточности [4, 5].
Согласно экспериментальным и клиническим данным, важную роль в развитии ХГН играют интерлейкины и факторы роста [6]. Клинико-генетические работы, посвященные молекулярно-генетическим аспектам ХГН, в России немногочисленны и затрагивают в основном интегральные мембранные белки [7], ряд интерлейкинов [6], факторы некроза опухоли [8]. Исследования роли полиморфных маркеров ряда генов интерлейкинов в отношении ХГН до сих пор не проведены.
Основная задача молекулярно-генетического типирования локусов генов интерлейкинов - это определение единичных нуклеотидных замен в генах, которые вызывают изменения уровня продукции интерлейкинов, что может влиять на развитие хронического воспалительного процесса.
Авторами в доступной научно-медицинской и патентной литературе не обнаружен способ оценки клинического течения хронического гломерулонефрита.
Задачей настоящего исследования является разработка способа оценки патогенетической значимости полиморфизмов генов интерлейкинов в течение хронического гломерулонефрита.
Технический результат использования изобретения - получение критериев оценки течения хронического гломерулонефрита, позволяющих в кратчайшие сроки определить клинический прогноз и стратегию терапии данного заболевания.
В соответствии с поставленной задачей был разработан способ особенностей клинического течения хронического гломерулонефрита на основе данных о полиморфизме генов интерлейкинов, включающий выделение ДНК из периферической венозной крови больных хроническим гломерулонефритом, выявление полиморфизмов генов интерлейкинов и в случае:
- выявления генотипа - 4257АА гена IL-13 делают вывод о вероятности формирования тяжелой артериальной гипертензии и высокого уровня среднесуточной протеинурии в течение заболевания;
- в случае выявления аллеля - 4257А гена IL-13 делают вывод о вероятности протекания ХГН с умеренной протеинурией.
Новизна и изобретательский уровень заключаются в том, что из уровня техники не известна возможность определения особенностей течения хронического гломерулонефрита по наличию аллелей и генотипов генов интерлейкинов.
Способ осуществляют следующим образом.
ДНК выделяют из образцов периферической венозной крови больных хроническим гломерулонефритом методом фенол-хлороформной экстракции.
Выделенную ДНК затем подвергают полимеразной цепной реакции с использованием стандартных олигонуклеотидных праймеров.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) синтеза полиморфных локусов интерлейкина 13-4257G/A IL-13 выполняется в 12,5 мкл общего объема смеси, содержащей 33,5 мМ трис-HCl (pH=8,8), 1,25 мМ MgCl2, 0,5 мкг геномной ДНК, по 5 пМ каждого праймера, по 100 мкМ dATP, dGTP, dCTP, dTTP и 1 единицу активной Taq-полимеразы.
Амплификат, наработанный при ПЦР полиморфных локусов генов интерлейкинов, подвергают рестрикции (ПДРФ-анализ) путем добавления к 12,5 мкл. амплификата 5 ед. активности рестриктазы и инкубируют в термостате при температуре 37°С в течение 16 часов. Для анализа полиморфизма гена интерлейкина 13-4257G/A IL-13 используют эндонуклеазу рестрикции BspLI ("СибЭнзим").
Продукты ПДРФ-анализа оцениваются путем разделения при помощи электрофореза в 2%-ном агарозном геле, приготовленном на основе ТВЕ-буфера, окрашенном раствором бромистого этидия (0,01%). В качестве электрофорезного буфера используют 1×TAE (трис-ацетатный буфер). Визуализация фореграмм осуществляется в темном боксе с трансиллюминатором фирмы UVP (Швеция).
Фрагменты длиной 156 п.н. соответствовали аллелю - 4257А гена IL-13, 138 и 18 п.н. - аллелю - 4257G, фрагменты длиной 156, 138 и 18 п.н. наблюдались у гетерозигот - 4257AG. Мутантный аллель - 4257А обусловливает повышение продукции интерлейкина 13 и IgE и, соответственно, обладает противовоспалительным и атопическим эффектами.
Формирование базы данных и статистические расчеты осуществляют с использованием программы «STATISTICA 6.0». Для оценки соответствия наблюдаемого распределения генотипов ожидаемому, исходя из равновесия Харди-Вайнберга, использован критерий χ2, наблюдаемая гетерозиготность, ожидаемая гетерозиготность, индекс фиксации Райта. Ассоциации аллелей и генотипов изученных ДНК-маркеров с предрасположенностью к хроническому гломерулонефриту, а также с качественными признаками, характеризующими его клинические особенности, оценивали с помощью анализа таблиц сопряженности 2×2 с расчетом критерия χ2 с поправкой Йетса на непрерывность и отношения шансов (OR) с 95% доверительными интервалами (CI). Взаимосвязи между количественными патогенетически значимыми признаками ХГН и полиморфизмами генов цитокинов изучали с помощью однофакторного и двухфакторного дисперсионного анализа.
Возможность использования предложенного способа для определения клинического прогноза и стратегии терапии данного заболевания подтверждает анализ результатов наблюдений 238 больных хроническим гломерулонефритом и 241 человек популяционного контроля. Пациенты включались в соответствующую группу больных только после установления диагноза заболевания, подтвержденного с помощью клинических и лабораторно-инструментальных методов обследования. Контрольную группу составили индивидуумы русской национальности, являющиеся уроженцами Белгородской области и не имеющие родства между собой.
Впервые выявлено, что генотип - 4257АА гена IL-13 является маркером:
- тяжелой артериальной гипертензии, частота встречаемости которого у больных с уровнем артериального давления >160/110 более чем в 3 раза превысила долю этого генотипа в контрольной группе (20,69% и 6,54% соответственно; χ2=3,99, р=0,05) (табл.1);
- высокого уровня среднесуточной протеинурии (4,70 г/сут. против 2,03 г/сут. и 2,37 г/сут. у пациентов с генотипами - 4257GG и - 4257AG соответственно; р=0,05), что подтверждает анализ ассоциации генотипов полиморфных генетических маркеров интерлейкинов со среднесуточной протеинурией у больных ХГН, проведенный с использованием дисперсионного анализа (табл.2). Коэффициент детерминации, показывающий какая доля изменчивости протеинурии обусловлена генотипами гена интерлейкина 13, составил 5,08% (табл.2).
Полученные данные согласуются с результатами анализа распределения генов и генотипов изучаемых полиморфных генетических систем в группах больных ХГН с разным уровнем протеинурии (незначительная протеинурия - до 1 г/сут, умеренная - 1-3 г/сут, выраженная - более 3 г/сут).
| Таблица 1 | ||||||||
| Сравнительный анализ частот аллелей и генотипов полиморфных маркеров генов интерлейкинов у больных ХГН в зависимости от уровня артериального давления (%) (начало) | ||||||||
| ен | Аллели, генотипы | Контрольная группа (n=241) | Уровень АД | Критерий различий, χ2 (p) | ||||
| <140/90 (n=79) | 140/90-159/109 (n=92) | >160/110 (n=52) | ||||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 1-2 | 1-3 | 1-4 | ||
| -4257G/A IL-13 | -4257G | 76,10 | 76,74 | 74,60 | 65,52 | 0,00 (1,00) | 0,00 (1,00) | 1,97 (0,16) |
| -4257А | 23,90 | 23,26 | 25,40 | 34,48 | ||||
| -4257GG | 59,56 | 65,12 | 58,73 | 51,72 | 0,22 (0,64) | 0,00 (1,00) | 0,32 (0,57) | |
| -4257AG | 33,09 | 23,26 | 31,75 | 27,59 | 1,06 (0,30) | 0,00 (0,98) | 0,13 (0,72) | |
| -4257АА | 6,54 | 11,63 | 9,52 | 20,69* | 0,32 (0,57) | 0,06 (0,81) | 3,99 (0,05) | |
| * - различия достоверны между больными и контрольной группой (р<0,05) | ||||||||
| Таблица 2 | |||
| Средний уровень протеинурии в зависимости от полиморфных маркеров генов интерлейкинов | |||
| Гены | Полиморфизм и его локализация в гене | Генотипы | Среднесуточная протеинурия (г) |
| IL-13 | -4257G/A (4 экзон) | -4257GG | 2,01±0,34 |
| -4257AG | 2,37±0,43 | ||
| -4257АА | 4,70±1,10 | ||
| h2 | 5,08 | ||
| Р | 0,05 | ||
| Примечание: h2 - коэффициент детерминации (%) | |||
Также впервые выявлено, что аллель - 4257А гена IL-13 является маркером умеренного уровня протеинурии. Пациенты с умеренной протеинурией характеризуются наибольшей частотой аллеля - 4257А гена IL-13 по сравнению с больными с незначительной протеинурией и выраженной протеинурией (42,86% против 22,73% и 26,76% соответственно; χ2=4,95-8,16, р=0,03-0,005) (табл.3).
| Таблица 3 | |||||||
| Сравнительный анализ частот аллелей и генотипов полиморфных маркеров генов интерлейкинов у больных ХГН в зависимости от степени протеинурии (%) (начало) | |||||||
| Гены | Аллели, генотипы | Уровень протеинурии | Критерий различий, χ2 (р) | ||||
| <1 г/сут | 1-3 г/сут | >3 г/сут | |||||
| 1 | 2 | 3 | 1-2 | 1-3 | 2-3 | ||
| -4257G/A IL-13 | -4257G | 77,27 | 57,14* | 73,33 | 8,16 (0,005) | 0,24 (0,62) | 4,95 (0,03) |
| -4257А | 22,73 | 42,86* | 26,67 | ||||
| -4257GG | 68,18 | 42,86 | 60,0 | 0,57 (0,45) | 0,03 (0,87) | 0,09 (0,77) | |
| -4257AG | 18,18 | 28,57 | 26,67 | 0,00 (0,96) | 0,04 (0,84) | 0,00 (1,00) | |
| -4257АА | 13,64 | 28,57 | 13,33 | 0,11 (0,74) | 0.00 (1,00) | 0,07 (0,79) | |
| *- различия достоверны (р<0,05) | |||||||
Таким образом, наличие у больных ХГН генотипа - 4257АА гена IL-13 обусловливает формирование тяжелой артериальной гипертензии и высокого уровня среднесуточной протеинурии в течение заболевания.
Аллель - 4257А гена IL-13 ассоциирован с умеренной протеинурией.
Литература.
1. Полещук Л.А. Характеристика почечной гемодинамики у детей с заболеваниями почек (Обзор литературы) // Нефрология и диализ. - 2006. - Т.8, №3. - С.225-232.
2. Мартынов С.А., Швецов М.Ю., Кутырина И.М. Нарушения суточного ритма артериального давления у больных хроническим гломерулонефритом // Терапевтический архив. - 2006. - Том 78, №1. - С.23-28.
3. Кутырина И.М., Руденко Т.Е., Швецов М.Ю., Кушнир В.В. Факторы риска сердечно-сосудистых осложнений у больных на додиализной стадии хронической почечной недостаточности // Терапевтический архив. - 2006. - Том 78, №5. - С.45-50.
4. Картамышева Н.Н., Чумакова О.В., Кучеренко А.Г., Сергеева Т.В. Прогрессирование хронического гломерулонефрита: клинико-морфологические взаимосвязи // Нефрология и диализ. - 2003. - т.5, №4. - С.395-398.
5. Ермоленко В.М., Козлова Т.А., Михайлова Н.А. Значение малобелковой диеты в замедлении прогрессирования хронической почечной недостаточности: обзор литературы // Нефрология и диализ. - 2006. - Т.8, №4. - С.310-321.
6. Петросян Э.К., Цыгин А.Н., Шестаков А.Е., Носиков В.В. Роль генетического полиморфизма интерлейкинов 4 и 13 в развитии нефротического синдрома с минимальными изменениями у детей и подростков // Педиатрия. - 2006. - №5. - С.7-10.
7. Шестаков А.Е., Камышова Е.С., Кутырина И.М. и др. Ассоциация полиморфных маркеров D6S2414 и D6S1271, расположенных в локусе МНС (6р21.31), с хроническим гломерулонефритом среди русских г.Москвы // Генетика. - 2006. - Т.42, №12. - С.1727-1730.
8. Некипелова Е.В., Чурносов М.И. Влияние генетических факторов на скорость прогрессирования хронического гломерулонефрита // Нефрология и диализ. - 2007. - Т.9, №3. - С.340.
Формула изобретения
Способ оценки особенностей клинического течения хронического гломерулонефрита, включающий выделение ДНК из периферической венозной крови больных хроническим гломерулонефритом, выявление полиморфизмов генов интерлейкинов, отличающийся тем, что в случае выявления генотипа - 4257АА гена IL-13 делают вывод о вероятности формирования тяжелой артериальной гипертензии и высокого уровня среднесуточной протеинурии в течение заболевания, а в случае выявления аллеля - 4257А гена IL-13 делают вывод вероятности протекания ХГН с умеренной протеинурией.
ИЗВЕЩЕНИЯ
PD4A Изменение наименования, фамилии, имени, отчества патентообладателя
(73) Патентообладатель(и):
Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Белгородский государственный национальный исследовательский университет» (RU)
Дата публикации: 10.04.2012
MM4A Досрочное прекращение действия патента из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе
Дата прекращения действия патента: 22.04.2012
Дата публикации: 20.02.2013