РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА ПО ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ

(19) RU (11) 2 441 674 (13) C1 (51) МПК A61M 1/38 (2006.01) A61K 38/43 (2006.01) A61K 38/17 (2006.01) A61P 37/00 (2006.01)

(54) СПОСОБ ОЧИСТКИ КРОВИ ОТ ДНК-СОДЕРЖАЩИХ ИММУННЫХ КОМПЛЕКСОВ С ПОМОЩЬЮ КОМБИНИРОВАННОГО СОРБЕНТА

Изобретение относится к области медицины, а именно к ревматологии, иммунологии и биотехнологии, и может быть использовано для совершенствования лечения системной красной волчанки и других аутоиммунных заболеваний.

Известно, что иммунные комплексы (ИК) оказывают выраженное влияние на тяжесть течения и прогноз различных заболеваний. В частности, доказана важная роль ДНК-содержащих ИК в прогрессировании поражения почек при системной красной волчанке, и тем самым в формировании прогноза жизни при данном заболевании. Показано, что ИК с высокомолекулярной ДНК наиболее патогенны, в отличие от ИК, содержащих ДНК малых размеров. Однако существующие в настоящее время способы удаления циркулирующих ИК (ЦИК) из кровотока (плазмаферез, гемосорбция, иммуносорбция с использованием иммобилизированных агентов, тропных к мономерным или агрегированным иммуноглобулинам) недостаточно избирательны в отношении элиминируемого вещества. Это приводит к значительной потере компонентов плазмы. Помимо необходимости заместительной терапии, следствием этого недостатка является существенное повышение частоты возникновения тяжелых бактериальных и вирусных инфекций, чему также способствует стандартная для лечения аутоиммунных заболеваний медикаментозная иммуносупрессия.

Удобным инструментом для разрушения ЦИК, содержащих высокомолекулярную ДНК, является дезоксирибонуклеаза I типа (ДНКаза I) - фермент, одной из физиологических функций которого является разрушение ДНК и нуклеопротеидов. Ранее нами был запатентован метод разрушения ДНК-содержащих ЦИК с помощью ДНКазы I, иммобилизированной на магнитоуправляемых полиакриламидных гранулах (МПГ) [Гонтарь И.П., Трофименко А.С., Зборовский А.Б., Шилова Л.Н., Симакова Е.С. Способ очистки крови от ДНК-содержащих иммунных комплексов с помощью иммобилизированного гранулированного магнитоуправляемого препарата: Патент RU 2356585 C2 // №заявки 2007105420/15; заявл. 13.02.2007; опубл. 27.05.2009, Бюл. №15. - 5 с.]. В дальнейшем данный метод обозначается как прототип.Прототип позволяет варьировать в широких пределах количество иммобилизированного фермента, а также использовать препарат многократно после проведения регенерации. При использовании прототипа в процессе обработки крови не происходит значительных изменений содержания форменных элементов. Прототип позволяет с высокой эффективностью разрушать высокомолекулярный дезоксирибонуклеиновый компонент ЦИК. Известно, что ДНК-содержащие ЦИК большого размера (более 20S) под действием ДНКазы I расщепляются через промежуточную стадию среднемолекулярных ЦИК (10S-20S) до небольших ЦИК (менее 10S). Последние намного менее патогенны, чем высокомолекулярные ЦИК, и быстрее элиминируются мононуклеарными фагоцитами печени и селезенки. Однако одним из продуктов ферментативного расщепления ДНК-содержащих ИК, помимо комплексов малого размера, могут быть свободные антитела к ДНК. Известно также, что при системной красной волчанке в состав ЦИК входят патогенные антитела к двуспиральной ДНК, значительное высвобождение которых в кровоток в процессе обработки крови иммобилизированной ДНКазой I нежелательно. Данный побочный эффект прототипа, обнаруженный нами в процессе испытаний in vivo на экспериментальной модели, представляет собой существенный недостаток и является основанием для доработки ранее запатентованного способа.

Уменьшение выброса антител к ДНК в кровоток в процессе расщепления ДНК-содержащих ЦИК ДНКазой I может быть достигнуто путем совместного применения иммобилизированного фермента и сорбента, фиксирующего антитела на промежуточной фазе ферментативной реакции в виде средне- или низкомолекулярных ЦИК. Этот способ технически более выгоден, чем сорбция свободных антител к ДНК, в связи со значительно меньшим количеством подлежащих сорбции молекул и, как следствие, с меньшей потребностью в сорбенте. Обязательным условием осуществления такой сорбционной процедуры является совместное применение иммобилизированной ДНКазы I и сорбента в одной перфузионной камере, наиболее удобным вариантом которого может быть использование композиции гранул с иммобилизированной ДНКазой I и гранул с сорбентом. Соблюдение этого условия дает возможность фиксировать короткоживущий промежуточный продукт ферментативной реакции - среднемолекулярные ЦИК - в месте его образования.

Перспективным лигандом для фиксации промежуточных продуктов распада ДНК-содержащих ЦИК является Clq-компонент комплемента (далее - Clq), реагирующий преимущественно со среднемолекулярными ИК [Kilgallon W., Amlot P.L., Williams B.D. Anti-Clq column: ligand specific purification of immune complexes from human serum or plasma. Analysis of the interaction between Clq and immune complexes // Clin. Exp.Immunol. - 1982. - Vol.48. - P.705-714]. Большая молекулярная масса Clq - около 460000 Да - упрощает его иммобилизацию, а нековалентный характер взаимодействия между Clq и ЦИК дает возможность легко регенерировать иммобилизированный Clq с помощью раствора с повышенной ионной силой. Еще одно важное преимущество заключается в возрастании активности плазменной ДНКазы I в присутствии Clq [Gaipl U.S., Beyer T.D., Heyder P. et1 al. Cooperation between Clq and DNase I in the clearance of necrotic cell-derived chromatin // Arthritis Rheum. - 2004. - Vol.50, N.2. - P.640-649]. При изучении уровня техники данных о совместном применении иммобилизированного Clq и иммобилизированной ДНКазы I для снижения уровня ДНК-содержащих ЦИК нами не найдено. Не выявлено также данных об иных иммобилизированных лигандах, используемых совместно с иммобилизированной ДНКазой I с целью снижения выделения антител к ДНК.

Известен способ селективного удаления из крови любого содержащегося в нем вещества, включающий определение его концентрации, добавление к раствору специфических антител в количестве, достаточном для связывания удаляемого вещества в составе ИК, и извлечение из раствора ЦИК, образованных de novo с помощью этих антител, с помощью твердофазного адсорбента на основе любого из трех лигандов: Clq, Fc-рецептора или ревматоидного фактора [Liberti P.A., Pollara P. Selective removal of immunospecifically recognizable substances from solution: Patent 4551435 USA // Appl. №06/526039; filed 24.08.1983; published 5.11.1985]. В качестве носителя для этих лигандов предлагается использовать полистироловый лист толщиной 0,1 мм, свернутый в спираль и помещенный в камеру, через которую перфузируется обрабатываемый раствор в направлении, соответствующем продольной оси спирали. Недостатками данного метода являются, во-первых, незначительная сорбционная емкость вследствие небольшой рабочей площади носителя; во-вторых, отсутствие магнитоуправляемости иммобилизированного Clq, что затрудняет манипуляции с препаратом. Более того, одновременное применение в единой перфузионной камере иммобилизированного таким образом Clq и МПГ на основе ДНКазы I крайне затруднено ввиду ограниченного расстояния между витками спирального листа, что нарушает подвижность МПГ и способствует повреждению гранул.

Решаемая задача состоит в разработке способа снижения содержания ДНК-содержащих циркулирующих иммунных комплексов путем пропускания крови через предварительно полученный методом эмульсионной полимеризации в потоке газообразного азота оригинальный комбинированный сорбент, представляющий собой смесь магнитоуправляемых полиакриламидных гранул с иммобилизированной ДНКазой I и магнитоуправляемых полиакриламидных гранул с иммобилизированным Clq (далее эта композиция обозначается как «комбинированный сорбент»), что обеспечивает снижение выброса антител к ДНК в кровоток по сравнению с прототипом.

Технический результат заявляемого изобретения представляет собой уменьшение количества антител к ДНК, выделяемых в кровоток в процессе разрушения ДНК-содержащих циркулирующих иммунных комплексов при пропускании крови через магнитоуправляемые полиакриламидные гранулы с иммобилизированной ДНКазой I. Технический результат достигается путем перфузии крови через комбинированный сорбент.

Способ очистки крови от ДНК-содержащих иммунных комплексов с помощью комбинированного сорбента осуществляют следующим образом.

Получение МПГ производится следующим способом. В сосуд, содержащий гексан и эмульгатор, подается под давлением по трубке химически инертный газ таким образом, чтобы создавать интенсивное перемешивание. В колбу для полимеризации вносится раствор окиси железа с гидрофильными свойствами и персульфат аммония, затем добавляется раствор, содержащий мономеры акриламида, метиленбисакриламида, NNN'N'-тетра-метилэтилендиамина и ДНКазы I. После завершения полимеризации МПГ отмывают от непрореагировавших мономеров, эмульгатора и гексана. МПГ с иммобилизированным Clq получают таким же способом, при этом единственным отличием от вышеприведенного является добавление Clq вместо ДНКазы I. Далее МПГ с ДНКазой I и МПГ с Clq смешивают, полученный комбинированный сорбент вносят в колонку и через нее перфузируется нативная гепаринизированная кровь. Регенерация препарата производится путем пропускания через колонку 1 М буфера глицин-HCl pH 2,2 дважды по 10 мин.

Пример 1. Получение МПГ с иммобилизированной ДНКазой I и МПГ с иммобилизированным Clq

МПГ с иммобилизированной ДНКазой I и МПГ с иммобилизированным Clq получали раздельно. В 2 мл 0,15 М раствора натрия хлорида растворяли соответственно 300 мг и 100 мг акриламида и метиленбисакриламида (Reanal, Венгрия). Для получения МПГ с иммобилизированной ДНКазой I к такому раствору добавляли 0,6 мг бычьей панкреатической ДНКазы I (Sigma-Aldrich, США), а для получения МПГ с иммобилизированным Clq - 0,6 мг Clq (Sigma-Aldrich, США).

В сосуд, содержащий 100 мл гексана и 0,5 мл эмульгатора СПЭН-85, подавали под давлением 0,2-1 атм газообразный азот по трубке сечением 0,8 мм таким образом, чтобы создавать интенсивное перемешивание в течение 5 мин. В колбу для полимеризации вносили 1 мл физиологического раствора pH 7,4 с 200 мг окиси железа с гидрофильными свойствами и 10 мг персульфата аммония. Через 1-2 мин добавляли 2 мл раствора, содержащего мономеры акриламида, метиленбисакриламида, иммобилизируемое вещество (ДНКазу I или Clq), а также 20 мкл NNN'N'-тетраметилэтилендиамина.

После завершения полимеризации гранулы в течение 10-15 мин отмывали ацетоном и физиологическим раствором с детергентом Твин-20 (0,05%) от непрореагировавших мономеров, эмульгатора и гексана. Гранулы имели стандартную сферическую форму с размером частиц геля 10-100 мкм. Соотношение полимерный носитель:железо=2:1 (в пересчете на сухую массу).

Пример 2. Перфузия крови через комбинированный сорбент и прототип.

В колонку объемом 40 мл вносили МПГ: при исследовании комбинированного сорбента - смесь МПГ с иммобилизированной ДНКазой I и МПГ с иммобилизированным Clq в соотношении 3:1 (объем: объем), при исследовании прототипа - МПГ с иммобилизированной ДНКазой I. Используя колонку с комбинированным сорбентом, проведена обработка нативной гепаринизированной крови 23 больных системной красной волчанкой (СКВ); для контроля применяли перфузию образцов крови тех же больных через прототип. Через колонку перфузировали со скоростью 10 мл/ч по 20 мл нативной гепаринизированной крови. Далее комбинированный сорбент и прототип отмывали от несвязавшихся белков забуференным физиологическим раствором pH 7,4 и проводили регенерацию 1 М глицин-HCl буфером pH 2,2 двукратно по 10 мин.

Содержание ЦИК в сыворотке крови определяли методом преципитации в поли-этиленгликоле-6000 по Haskova в модификации Лемперта (1988), концентрацию сывороточных антител к двуспиральной ДНК - методом ИФА с использованием коммерческих наборов (Orgentec Diagnostika, Германия), также оценивали содержание форменных элементов крови (эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов). Значения всех исследуемых показателей для каждого образца измеряли двукратно - до и после перфузии.

Динамика сывороточных концентраций ЦИК и антител к двуспиральной ДНК в результате осуществления заявляемого способа приведена в таблице 1, динамика концентрации форменных элементов крови - в таблице 2. Из указанных значений следует, что при перфузии через комбинированный сорбент достигается снижение содержания ЦИК на 69,7% от исходного, а при перфузии через прототип - на 61,8% от исходного, при этом различия как абсолютных значений концентрации ЦИК, так и темпов убыли последней не являются статистически достоверными. Однако при перфузии крови через прототип концентрация антител к двуспиральной ДНК повышается на 15,7%, а при использовании комбинированного сорбента - на 8,4%; данное различие является статистически значимым. При использовании обоих способов содержание форменных элементов крови достоверно не изменяется. Следовательно, полученные при прямом сопоставлении с прототипом данные свидетельствуют о значительном снижении выброса антител к двуспиральной ДНК и сохранении эффективности разрушения ДНК-содержащих ЦИК при использовании заявляемого способа.

После использования комбинированный сорбент и прототип регенерировали 1 М глицин-HCl буфером, pH 2,2. После первой регенерации потеря удельной ДНКазной активности составила 11% для обоих препаратов, эффект в отношении антител к двуспиральной ДНК существенно не изменялся. При последующих повторных регенерациях (до 10 раз) потери активности иммобилизированных лигандов не происходило.

МКИ A61M 1/38 A61P 37/00

СПОСОБ ОЧИСТКИ КРОВИ ОТ ДНК-СОДЕРЖАЩИХ ИММУННЫХ КОМПЛЕКСОВ С ПОМОЩЬЮ КОМБИНИРОВАННОГО СОРБЕНТА

Таблица 1
Изменение концентраций циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) и антител к двуспиральной ДНК в результате перфузии через комбинированный сорбент и через прототип
Показатель	Исходно	После перфузии		p
		через комбинированный сорбент	через прототип
ЦИК	7,6 (6,7-8,5)	2,3(1,1-3,5)	2,9 (2,0-3,8)	0,845∗
- значение, Ед (М (95%ДИ))
- темп прироста, %	-	-69,7	-61,8	0,671^
Антитела к двуспиральной ДНК	46,4 (36,9-55,9)	50,3 (39,7-60,9)	53,7 (44,2-63,2)	0,029∗
- значение, МЕ/мл (М (95%ДИ))
- темп прироста, %	-	8,4	15,7	0,034^

∗ - для различия между комбинированным сорбентом и прототипом, непарный критерий Стьюдента

^ - для различия между комбинированным сорбентом и прототипом, точный критерий Фишера

Таблица 2
Изменение концентраций форменных элементов крови в результате перфузии через комбинированный сорбент и через прототип
Показатель	Исходно	После перфузии		p∗
		через комбинированный сорбент	через прототип
Эритроциты, ×1012 л-1 (М (95%ДИ))	3,6 (2,4-1,8)	3,8 (2,4-5,2)	4,0 (2,6-5,4)	0,710
Лейкоциты, ×109 л-1 (М (95%ДИ))	5,2(1,8-8,6)	4,0(1,1-6,9)	4,3 (0,6-8,0)	0,294
Тромбоциты, ×109 л-1 (М (95%ДИ))	272,6(189,1-356,1)	252,7 (200,6-304,8)	245,3 (174,8-315,8)	0,924

∗ - для различия между комбинированным сорбентом и прототипом, непарный критерий Стьюдента

Формула изобретения

Способ снижения содержания ДНК-содержащих циркулирующих иммунных комплексов, включающий пропускание крови через гранулированный препарат с иммобилизированной ДНКазой I на основе полиакриламидного носителя с магнитными свойствами, который гранулируют методом эмульсионной полимеризации при соотношении носитель:железо 2:1, отличающийся тем, что кровь пропускают через композицию, состоящую из, во-первых, гранулированного препарата с иммобилизированной ДНКазой I на основе полиакриламидного носителя с магнитными свойствами и, во-вторых, гранулированного препарата с иммобилизированным Clq-компонентом комплемента на основе полиакриламидного носителя с магнитными свойствами, который гранулируют методом эмульсионной полимеризации при соотношении носитель:железо 2:1.

ИЗВЕЩЕНИЯ

MM4A Досрочное прекращение действия патента из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 10.07.2012

Дата публикации: 10.05.2013

NF4A Восстановление действия патента

Дата, с которой действие патента восстановлено: 20.06.2014

Дата внесения записи в Государственный реестр: 27.05.2014

Дата публикации: 20.06.2014

MM4A Досрочное прекращение действия патента из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 10.07.2015

Дата публикации: 20.03.2016

NF4A Восстановление действия патента

Дата, с которой действие патента восстановлено: 11.05.2017

Дата внесения записи в Государственный реестр: 11.05.2017

Дата публикации: 11.05.2017

MM4A Досрочное прекращение действия патента из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 10.07.2019

Дата внесения записи в Государственный реестр: 08.06.2020

Дата публикации и номер бюллетеня: 08.06.2020 Бюл. №16